kinetyka reakcji enzymatycznych - sprawozdanie

KINETYKA REAKCJI ENZYMATYCZNYCH - I
Inwertaza (sacharoza) jest enzymem należącym do hydrolaz, rozszczepiającym wiązania β-glikozydowe w związkach O-glikiozylowych. Działanie tego enzymu polega na hydrolizie końcowych nieredukujących reszt β-D-fruktofuranozydowych. Produktami hydrolizy sacharozy są D-glukoza i D-fruktoza. Zjawisku temu towarzyszy zmiana skręcalności właściwej. Inwertaza powszechnie występuje w roślinach, a także w drożdżach piwnych i piekarskich (najwyższe stężenie). Jest to enzym wewnątrzkomórkowy. Do izolacji enzymu stosuje się np. autolizę, rozbicie komórek za pomocą homogenizatora ostrzowego lub przez ucieranie drożdży z piaskiem w obecności eteru i ekstrakcję białek wodą. Do oczyszczania inwertazy można wykorzystać jej małą podatność na strącanie kwasem pikrynowym. Wytrącanie enzymu przeprowadza się też acetonem w niskiej temperaturze. Oznaczanie aktywności inwertazy opiera się na pomiarze stężenia cukrów redukujących (glukozy i fruktozy) pojawiających się w miarę postępowania enzymatycznej hydrolizy sacharozy. Roztwór gotuje się z odczynnikiem zawierającym dwuwartościową miedź (roztwór odczynników Somogyi I i II w stosunku 4:1). W wyniku redukcji powstaje ceglasty osad Cu2O, który rozpuszczany jest w odczynniku Nelsona, pojawia się niebiesko-zielone zabarwienie roztworu, którego absorbancję odczytuje się przy długości fali 520 nm. Otrzymywanie preparatu inwertazy 10g świeżych drożdży piekarskich zhomogenizowano w 50 ml zimnej wody destylowanej za pomocą homogenizatora ostrzowego (5 tys. obrotów/min. Przez 2min.). Niską temperaturę utrzymywano dzięki mieszaninie wody z lodem. Homogenat odwirowano w wirówce K-23 przy 3 tys.obrotów/min. przez 15min. Uzyskany supernatant z surowym enzymem zlano do naczynek i przechowywano w lodówce, a część zamrożono. Przesączono supernatant przez Miracloth. Wyznaczenie krzywej kalibracyjnej Przygotowano szereg probówek zawierających po 1ml odpowiednio rozcieńczonego buforem glicynowym (pH 10) wzorcowego roztwóru glukozy-fruktozy (10 mg%). Uzyskano następujące stężenia roztworów: 0μg/ml, 10 μg/ml, 20 μg/ml, 30 μg/ml, 40 μg/ml, 50 μg/ml, 75 μg/ml, 100 μg/ml. Wymieszano, wlano 1 ml mieszaniny odczynników Somogyi I i II, probówki zatkano i ogrzewano przez 15 min.we wrzącej łaźni wodnej. Następnie ostudzono pod bieżącą wodą i dodano 1 ml odczynnika Nelsona i 2ml wody destylowanej. Odczytano wartośc absorbancji przy dł.fali 520 nm wobec próby odczynnikowej:
C (μg/ml) A520 2. 10 μg/ml 0,113 3. 20 μg/ml 0,360; 0,375 4. 30 μg/ml 0,490 5. 40 μg/ml 0,750; 0,607 6. 50 μg/ml 0,827; 0,875 7. 75 μg/ml 1,402; 1,402 8. 100 μg/ml 1,859 Część II Przygotowano szereg probówek dla mniejszych stężeń glukozy-fruktozy stosując do rozcieńczania wyjściowy roztwór 1mg%. Pozostałe czynności wykonano jak w poprzedniej części. ... zobacz całą notatkę