Kinetyka reakcji enzymatycznych - wykład

Nasza ocena:

3
Pobrań: 119
Wyświetleń: 1379
Komentarze: 0
Notatek.pl

Pobierz ten dokument za darmo

Podgląd dokumentu
Kinetyka reakcji enzymatycznych - wykład - strona 1 Kinetyka reakcji enzymatycznych - wykład - strona 2 Kinetyka reakcji enzymatycznych - wykład - strona 3

Fragment notatki:

ZAKŁAD BIOCHEMII ENZYMOLOGIA Biochemia i Biotechnologia
UMCS (KP/KR) 2012
KINETYKA REAKCJI ENZYMATYCZNYCH - I
Ćwicz. 1-2
Podstawy kinetyki reakcji enzymatycznych zostały stworzone dzięki modelowi kinetycznemu, jaki w 1913 r. zaproponował Leonor Michaelis i Maud Menten do ilościowego opisu reakcji enzymatycznej w oparciu o prowadzone przez nich badania aktywności inwertazy.
Zastosowanie tego właśnie enzymu do badań praktycznych na ćwiczeniach zostało dodatkowo podyktowane zarówno dostępnością enzymu i substratu, jak też stosunkowo niskimi kosztami odczynników.
Inwertaza (sacharaza) według obowiązującej nomenklatury enzymów jest β-D-fruktozydazą (EC 3.2.1.26), należy do klasy hydrolaz rozszczepiających wiązanie β-glikozydowe (glikozydaz - 3.2) w związkach O-glikozylowych (3.2.1). Działanie enzymu polega na hydrolizie końcowych nieredukujących reszt β-D-fruktofuranozydowych. W przypadku sacharozy (α-D-glukopiranozylo-β-D-fruktofuranozy) produktem hydrolizy jest D-glukoza i D-fruktoza (cukier inwertowany). Hydrolizę sacharozy nazywa się inwersją ze względu na towarzyszącą temu zjawisku zmianę skręcalności właściwej z [α]D= 66,6o na [α]D= −20o.
Inwertaza jest enzymem rozpowszechnionym w roślinach, jednak najlepszym źródłem otrzymywania jej preparatów są drożdże piwne lub piekarskie, w których występuje ona w najwyższym stężeniu. Inwertaza jest enzymem wewnątrzkomórkowym i do jego ekstrakcji konieczne jest rozbicie błon komórkowych. Istnieje szereg metod otrzymywania i oczyszczania preparatów inwertazy. Do izolacji enzymu można stosować np. autolizę (przez kilka godzin w 0,1M NaHCO3, w temp. 40oC), rozbicie komórek za pomocą homogenizatora ostrzowego lub przez ucieranie drożdży z piaskiem w obecności eteru i ekstrakcję białek wodą.
Do oczyszczania inwertazy można wykorzystywać jej małą podatność na strącanie kwasem pikrynowym. Wytrącanie enzymu przeprowadza się też acetonem w niskiej temperaturze (ochrona przed denaturacją).
Zasada oznaczania aktywności inwertazy opiera się na pomiarze stężenia cukrów redukujących (glukozy i fruktozy) pojawiających się w miarę postępowania enzymatycznej hydrolizy sacharozy. Roztwór, w którym znajdują się uwolnione podczas hydrolizy monosacharydy gotuje się z odczynnikiem zawierającym miedź dwuwartościową (mieszanina odczynników Somogyi I i II, w stosunku 4:1). Powstający w wyniku redukcji ceglasty osad Cu2O rozpuszcza się następnie w odczynniku Nelsona (arsenomolibdenowym) i uzyskuje roztwór o niebiesko-zielonym zabarwieniu, którego absorbancję odczytuje się przy długości fali 520 nm. Natężenie barwy jest wprost proporcjonalne do stężenia powstałego produktu.


(…)

… kalibracyjną dla mniejszych stężeń glukozy-fruktozy (dla zakresu stężeń 0-10 μg/ml), stosując jako wyjściowy do rozcieńczania (analogicznie jak w tabeli powyżej) roztwór o stężeniu 1 mg% (przygotowany z r-ru o stęż. 10 mg%).
Wszystkie pozostałe czynności wykonać zgodnie z procedurą podaną powyżej (w punkcie 1.)
Odczynniki
Świeże drożdże piekarskie
0,1 M bufor octanowy (octan sodu - kwas octowy) o pH 4,7
0,2 M roztwór sacharozy w buforze octanowym o pH 4,7
0,1 M bufor glicynowy (glicyna - NaOH) o pH 10
10 mg% roztwór wzorcowy glukozy-fruktozy w buforze glicynowym o pH 10
Odczynnik Somogyi I
288 g Na2SO4 (bezw.) rozpuścić w 1 l H2O dest. Dodać 24 g soli Rochelle'a (winian sodowo potasowy), 48 g Na2CO3, 32 g NaHCO3. Roztwór rozcieńczyć do 1600 ml gotowaną H2O dest. i przechowywać w temp. 27OC.
Odczynnik Somogyi…
… Na2H-arsenian w 100 ml H2O). Odczynnik przechowywać w ciemnej butelce szklanej przez 24-48 godz. w temp. 37OC, potem w pokojowej.
Zimna woda destylowana Lód
Sprzęt
waga techniczna
homogenizator ostrzowy
wirówka K-23
łaźnia wodna (100oC)
micro-shaker (wytrząsarka)
spektrofotometr
stoper
probówki ze szczelnymi korkami
probówki krótkie
pipety automatyczne
11. cylindry miarowe, zlewki, kolbki (poj. 50…
... zobacz całą notatkę

Komentarze użytkowników (0)

Zaloguj się, aby dodać komentarz