To tylko jedna z 4 stron tej notatki. Zaloguj się aby zobaczyć ten dokument.
Zobacz
całą notatkę
ZAKŁAD BIOCHEMII ENZYMOLOGIA Biochemia i Biotechnologia
UMCS (KP/KR) 2012
KINETYKA REAKCJI ENZYMATYCZNYCH - I
Ćwicz. 1-2
Podstawy kinetyki reakcji enzymatycznych zostały stworzone dzięki modelowi kinetycznemu, jaki w 1913 r. zaproponował Leonor Michaelis i Maud Menten do ilościowego opisu reakcji enzymatycznej w oparciu o prowadzone przez nich badania aktywności inwertazy.
Zastosowanie tego właśnie enzymu do badań praktycznych na ćwiczeniach zostało dodatkowo podyktowane zarówno dostępnością enzymu i substratu, jak też stosunkowo niskimi kosztami odczynników.
Inwertaza (sacharaza) według obowiązującej nomenklatury enzymów jest β-D-fruktozydazą (EC 3.2.1.26), należy do klasy hydrolaz rozszczepiających wiązanie β-glikozydowe (glikozydaz - 3.2) w związkach O-glikozylowych (3.2.1). Działanie enzymu polega na hydrolizie końcowych nieredukujących reszt β-D-fruktofuranozydowych. W przypadku sacharozy (α-D-glukopiranozylo-β-D-fruktofuranozy) produktem hydrolizy jest D-glukoza i D-fruktoza (cukier inwertowany). Hydrolizę sacharozy nazywa się inwersją ze względu na towarzyszącą temu zjawisku zmianę skręcalności właściwej z [α]D= 66,6o na [α]D= −20o.
Inwertaza jest enzymem rozpowszechnionym w roślinach, jednak najlepszym źródłem otrzymywania jej preparatów są drożdże piwne lub piekarskie, w których występuje ona w najwyższym stężeniu. Inwertaza jest enzymem wewnątrzkomórkowym i do jego ekstrakcji konieczne jest rozbicie błon komórkowych. Istnieje szereg metod otrzymywania i oczyszczania preparatów inwertazy. Do izolacji enzymu można stosować np. autolizę (przez kilka godzin w 0,1M NaHCO3, w temp. 40oC), rozbicie komórek za pomocą homogenizatora ostrzowego lub przez ucieranie drożdży z piaskiem w obecności eteru i ekstrakcję białek wodą.
Do oczyszczania inwertazy można wykorzystywać jej małą podatność na strącanie kwasem pikrynowym. Wytrącanie enzymu przeprowadza się też acetonem w niskiej temperaturze (ochrona przed denaturacją).
Zasada oznaczania aktywności inwertazy opiera się na pomiarze stężenia cukrów redukujących (glukozy i fruktozy) pojawiających się w miarę postępowania enzymatycznej hydrolizy sacharozy. Roztwór, w którym znajdują się uwolnione podczas hydrolizy monosacharydy gotuje się z odczynnikiem zawierającym miedź dwuwartościową (mieszanina odczynników Somogyi I i II, w stosunku 4:1). Powstający w wyniku redukcji ceglasty osad Cu2O rozpuszcza się następnie w odczynniku Nelsona (arsenomolibdenowym) i uzyskuje roztwór o niebiesko-zielonym zabarwieniu, którego absorbancję odczytuje się przy długości fali 520 nm. Natężenie barwy jest wprost proporcjonalne do stężenia powstałego produktu.
(…)
… kalibracyjną dla mniejszych stężeń glukozy-fruktozy (dla zakresu stężeń 0-10 μg/ml), stosując jako wyjściowy do rozcieńczania (analogicznie jak w tabeli powyżej) roztwór o stężeniu 1 mg% (przygotowany z r-ru o stęż. 10 mg%).
Wszystkie pozostałe czynności wykonać zgodnie z procedurą podaną powyżej (w punkcie 1.)
Odczynniki
Świeże drożdże piekarskie
0,1 M bufor octanowy (octan sodu - kwas octowy) o pH 4,7
0,2 M roztwór sacharozy w buforze octanowym o pH 4,7
0,1 M bufor glicynowy (glicyna - NaOH) o pH 10
10 mg% roztwór wzorcowy glukozy-fruktozy w buforze glicynowym o pH 10
Odczynnik Somogyi I
288 g Na2SO4 (bezw.) rozpuścić w 1 l H2O dest. Dodać 24 g soli Rochelle'a (winian sodowo potasowy), 48 g Na2CO3, 32 g NaHCO3. Roztwór rozcieńczyć do 1600 ml gotowaną H2O dest. i przechowywać w temp. 27OC.
Odczynnik Somogyi…
… Na2H-arsenian w 100 ml H2O). Odczynnik przechowywać w ciemnej butelce szklanej przez 24-48 godz. w temp. 37OC, potem w pokojowej.
Zimna woda destylowana Lód
Sprzęt
waga techniczna
homogenizator ostrzowy
wirówka K-23
łaźnia wodna (100oC)
micro-shaker (wytrząsarka)
spektrofotometr
stoper
probówki ze szczelnymi korkami
probówki krótkie
pipety automatyczne
11. cylindry miarowe, zlewki, kolbki (poj. 50…
... zobacz całą notatkę
Komentarze użytkowników (0)