Etapy PCR, sem VI

ETAPY PCR: Wstępna denaturacja: Całkowita denaturacja DNA na początku reakcji PCR jest bardzo istotna. Niepełna denaturacja sprawia, że nie całe DNA może być wykorzystane jako matryca w I cyklu, a to z kolei powoduje zmniejszenie ilości amplifikowanych produktów. Etap wstępnej denaturacji powinien trwać 1-3 min w temp. 94-95 ̊C , a jeśli matrycowe DNA jest szczególnie bogate w GC, można wydłużyć czas denaturacji do 10 min. Etap denaturacji: Zazwyczaj wystarcza 1-2 min denaturacji w temp. 94-95 ̊C z uwagi na to, że produkty reakcji PCR są krótsze od matrycowego DNA i w krótszym czasie ulegają kompletnej denaturacji. Jeśli amplifikowane fragmenty są bogate w GC, można wydłużyć czas denaturacji do 3-4 min lub zastosować czynniki wspomagające denaturację: 5% glicerol, 10% DMSO, 5% formamid. Należy również zwiększyć ilość polimerazy, gdyż DMSO i formamid w podanych stężeniach obniżają aktywność polimerazy o 50%.
Etapy annealingu startera: optymalna temperatura annealingu jest zazwyczaj o 5 ̊C niższa od temp. topnienia dupleksu starter-matryca DNA, a czas trwania etapu to 1-2 min. Jeśli uzyskiwane są produkty niespecyficzne należy o 1-2 ̊C podnieść temperaturę przyłączenia. Etap elongacji: przebiega w temp. 70-75 ̊C. Teoretyczny czas wydłużania to 1 min na każde 1000 pz powstającego produktu.
Etap końcowy elongacji: po ostatnim cyklu następuje etap końcowy wydłużenia trwający 5-15 min w temp. 72 ̊C. Ma on na celu dobudowanie niedokończonych w trakcie poprzednich cykli fragmentów Dna. W trakcie tego etapu polimeraza Tag działa jako terminalna transferaza i dosyntetyzowuje dodatkowe nukleotydy A do końców trzech produktów PCR.
OPTYMALIZACJA WARUNKÓW PCR: 1) specyficzność: -podwyższyć temperaturę annalingu starterów, - dobrać odpowiednie stężenie jonów Mg2+, -zmienić skład nukleotydowy struktury, - zmienić ilość cykli, -zmienić polimerazę. 2)wierność: -obniżyć liczbę cykli, -zmienić stężenie matrycy, -obniżyć stężenie dNTP, -zmienić polimerazę. 3)ilość produktu: -zwiększyć liczbę cykli, - podwyższyć stężenie matrycy, -zmienić polimerazę, -obniżyć temp. annealingu 4)długość produktu: -wydłużyć czas elongacji, -dobrać odpowiednie stężenie jonów Mg2+, -zmienić polimerazę, -skrócić czas denaturacji, -zmienić pH buforu do PCR.
... zobacz całą notatkę