Przygotowanie sekwencji genomowej do klonowania - omówienie

Nasza ocena:

3
Pobrań: 105
Wyświetleń: 1554
Komentarze: 0
Notatek.pl

Pobierz ten dokument za darmo

Podgląd dokumentu
 Przygotowanie sekwencji genomowej do klonowania - omówienie - strona 1  Przygotowanie sekwencji genomowej do klonowania - omówienie - strona 2  Przygotowanie sekwencji genomowej do klonowania - omówienie - strona 3

Fragment notatki:

Przygotowanie sekwencji genomowej do klonowania
1. Opis zasady izolacji DNA genomowego.
1) Rozmrożone kom w TE:
Tris-HCl- utrzymuje zasadowe pH (pH=8), w innym pH mogłoby dojść do uszkodzenia DNA na skutek rozerwania wiązań. Musi być zachowane odpowiednie pH aby cząsteczka DNA pozostała cząsteczką natywną i dobrze się rozpuszczała. EDTA- chelatuje jony dwuwartościowe, np. jony Mg2+, które są kofaktorem dla nukleaz, na skutek czego dochodzi do zablokowania DNA-az, chroniona jest cząsteczka DNA przed degradacją przez DNA-azy.
2) „lysis solution”- zawiera np. lizozym, który odpowiada za degradację (hydrolizę) peptydoglikanu w ścianie komórkowej. Do lizy komórki można użyć detergentów, np. SDS, NaOH- degradacja i denaturacja białek, liza komórki. SDS- detergent, który tworzy kompleksy z białkami. Kompleksowanie to wymusza zmiany strukturalne, które nie korespondują z natywnym ufałdowaniem łańcucha polipeptydowego, co w efekcie doprowadza do denaturacji białka.
3) 65˚C- dalsza dezaktywacja enzymów nukleolitycznych (na skutek ich denaturacji) pomimo wcześniej użytego EDTA. 4) Chloroform- odbiałczanie, po wir rozdział preparatu na 3 fazy: fazę górną (wodną) z DNA, fazę białkową (kożuszek) oraz fazę dolną (organiczną) z chloroformem. Oddzielenie DNA od zanieczyszczeń, zdenaturyzowanych białek.
5) r-ór do precypitacji DNA „concentrated precipitation solution”- DNA wytrąca się w postaci białego osadu.
6) rozpuszczamy osad w 1.2 M NaCl. DNA jest kwasem którego reszty są naładowane ujemnie. Dzięki temu jony Na+ z soli NaCl otaczają cząsteczkę DNA.
7) zimny alkohol- etanol. Przy wysokim stężeniu soli NaCl, w obecności alkoholu, DNA zmienia swoją przestrzenna strukturę i tworzy agregaty (duże, nieuporządkowane kompleksy)- wytrąca  się.
8) rozpuszczamy DNA w wodzie- rozpuszcza się, ponieważ woda powoduje zobojętnie pH
2-niciowe DNA: C µg/ml= A260 x 50 µg/ml x rozcieńczenie
1-niciowe DNA: C µg/ml= A260 x 33 µg/ml x rozcieńczenie
RNA: C µg/ml= A260 x 40 µg/ml x rozcieńczenie
Czystość preparatu: Stosunek A260 do A280- poniżej 1,8- zanieczyszczczenie białkami, Stosunek- 1,5 zanieczyszczenie białkami w 50%. Wiązka światła o długości fali 260 nm- pochłaniana przez DNA(RNA), 280 nm- przez białka.
Inne zanieczyszczenia DNA pochłaniają inne długości fali. 3. Opis przebiegu reakcji PCR na poziomie molekularnym wraz z zasadą reakcji touchdown PCR.
Matryca (DNA):
nie może być zdegradowana (żeby przyłączyły się startery)
bez zanieczyszczeć białkowych i innych.


(…)

… przez polimerazę DNA zależną od DNA.
Cechy PCR:
wykładnicza amplifikacja
generacja fragmentów o identycznej sekwencji i określonej długości
możliwość przeprowadzenia w przypadku posiadania wiedzy tylko o skrajnych fragmentach sekwencji
czułość w odniesieniu do matrycy wyjściowej.
Mieszanina reakcyjna do PCR:
1. woda
2. bufor- specyficzny dla każdej polimerazy. Stabilizuje pH mieszaniny reakcyjnej. Zwykle…
... zobacz całą notatkę

Komentarze użytkowników (0)

Zaloguj się, aby dodać komentarz