To tylko jedna z 3 stron tej notatki. Zaloguj się aby zobaczyć ten dokument.
Zobacz
całą notatkę
Łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR- Polimerase Chain Reaction)
1987 Mullins, Nobel 1993
Przełom w technologii pozyskiwania i analizie dużej ilości fragmentów DNA
Wykorzystuje naturalny proces replikacji- synteza komplementarnej nici DNA, ograniczonych położeniem starterów. W każdym cyklu- podwojenie wyjściowej liczby matryc (po 30 wykłądniczy wzrost do ok. 100 mln)
Podstawowa, jakościowa technika inż. Gen. Umożliwia specyficzną amplifikację in vitro wybranych odcinków DNA, dzieki wykorzystaniu pary starterów (primers)- krótkie jednoniciowe odcinki DNA komplementarne do sekwencji docelowej. Czułość reakcji umożliwia powielenie konkretnych fragmentów genomu/ genu miliony razy
Standardowa procedura: 25-40 powtarzających się cykli, każdy obejmuje: denaturację, wiązanie starterów i syntezę nowej nici przez termostabilna polimerazę
Mieszanina reakcyjna: bufor Mg2+, matryca (DNA lub RNA), 2 komplementarne do niej startery (ograniczają długość syntetyzowanego łańcucha), dNTP (substraty reakcji syntezy), polimeraza DNA
Przebieg reakcji PCR:
I etap cyklu: powielany fragment (matryca) ogrzana do 95stC- rozdział nici (denaturacja)
II etap: temp 45-65stC- przyłączenie startera do matrycy (hybrydyzacja starter-matryca), temp zalezy od długości startera, składu nukleotydowego startera i zawartości w nim par GC.
III etap: temp do 72stC, optymalna dla polimerazy (syntezy) nowego łańcucha
W pierwszym cyklu syntezy nowego łańcucha każda nić docelowego DNA kopiowana jest od miejsca przyłączania startera na różną długość, co trwa aż do rozpoczęcia II cyklu
W nim mieszanina reakcyjna ponownie ogrzewana jest do 95stC, następnie drugi starter może wiązać się do powstałej, nowej nici DNA i podczas polimeryzacji kopiować tę nić aż do miejsca, w którym znajdował się początek pierwszego statera. W końcowym etapie II cyklu występują już cząsteczki nowo syntetyzowane o właściwej długości
Reakcja trwa aż do ukończenia zaplanowanej liczby cykli bądź wyczerpania jednego ze składników reakcji
Warunki reakcji PCR:
Matryce- minimalne ilości DNA z dowolnej tkanki
Podstawa reakcji- znajomość sekwencji flankujących powielany odcinek DNA, co umozliwia syntezę komplementarnych starterów.
Przebieg warunkowany m.in. właściwymi proporcjami komponentów.
Stężenie polimerazy 0,7-1U/reakcję.
Nadmiar: niespecyficzne produkty
Niedobór: brak produktów
Odpowiednie stężenie Mg
Specyficzność zapewniają startery (dł 16-26 nukleotydów). Skład i stężenie skorelowane ze stężeniem pozostałych komponentów reakcji.
(…)
… (poznawcze)- mapowanie i sekwencjonowanie genomów (m,in HGP), taksonomia, antropologia
Biotechnologia- produkcja rekombinowanych białek (insulina, hormon wzrostu), wykorzystywane jako leki, rozwój technologii rekombinowanych szczepionek (przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby)
Badanie chorób dziedzicznych- wykrywanie mutacji genów przekazywanych dziedzicznie (hemofilia, mukowiscydoza), genotypowanie…
… przebiegu reakcji przez pomiar fluorescencji sond lub barwnikó wprowadzonych do reakcji.
Te łącząc się z amplifikowanym DNA emitują fluorescencje proporcjonalnie do ilości produktu w każdym cyklu reakcji.
Do uzyskania sygnału stosowane są interkalujące barwniki (bromek etydyny, SYBR Greek I) i hybrydyzujące sondy.
Materiał wyjściowy: DNA, RNA (tu należy zsyntetyzować komplementarny DNA (cDNA) za pomocą odwrotnej transkryptazy, stosując RNA jako matrycę.
Kilka metod analizy przyrostu ilości produktów w reakcji PCR- wszystkie oparte na związkach fluorescencyjnych. Wymagają termocyklera sprzężonego z fluorometrem (pomiar fluorescencji w trakcie trwania reakcji PCR)
Wykorzystanie- analiza poziomu ekspresji genu, genotypowanie, pomiar kinetyki reakcji.
…
... zobacz całą notatkę
Komentarze użytkowników (0)