SKŁADNIKI MIESZANINY REAKCYJNEJ: matrycowe DNA; starter; MgCl2; dNTP, polimeraza; bufor do PCR. MATRYCOWE DNA: nie może być zdegradowane ani zanieczyszczone. Inhibitorami PCR są m.in. fend, EDTA, proteinoza K. Najczęściej w 20 μl mieszaniny reakcyjnej stosuje się 10-100 ng matrycy. Zbyt duża ilość DNA powoduje amplifikację niespecyficznych produktów DNA. STARTER (primer): Starter jest jednoniciowym fragmentem DNA o dł. 18-28 par zasad (pz, bp). Zawartość GC powinna wynosić 50-60% i powinny być one równomiernie rozłożone na całej długości startera. Starter nie może być komplementarny do samego siebie ani do innych starterów w mieszaninie reakcyjnej. Temperatura topnienia starterów flankujących dany fragment nie powinna różnić się o więcej niż 5 ̊C. Jeśli dysponujemy sekwencją matrycowego DNA, należy rozpatrzyć wszystkie możliwe miejsca przyłączenia starterów. Optymalne stężenie starterów to 0,1-0,5 μM. MgCl2: Jony Mg2+są kolektorami polimerazy DNA. Stężenie jonów magnezu powinno być dobrane eksperymentalnie ze względu na to, że tworzą kompleksy z takimi składnikami reakcji jak: DTP, startery i matrycowe DNA. Dokładność PCR jest proporcjonalna do stężenia wolnych jonów Mg2+. Zbyt mała ich ilość obniża ilość produktów PCR, zaś zbyt duża powoduje pojawienie się produktów niespecyficznych. Z reguły stosuje się stężenie jonów Mg w zakresie 1-4 mM. Jeśli matrycowe DNA zanieczyszczone jest związkami chelatującymi np. EDTA, należy podwyższyć stężenie Mg2+ . dNTP: jest to mieszanina deoksynukleozydotrifosforanów: dATP, dCTP, dGTP, dTTP. Stężenie w roztworze powinno wynosić 20-200 μM każdego nukleotydu. Ważne jest aby w mieszaninie reakcyjnej stężenie każdego dNTP było jednakowe, ponieważ nadmiar lub niedobór chociaż jednego z nukleotydów powoduje ich mylne przyłączenie w trakcie amplifikacji. Są wrażliwe na warunki, dlatego przechowuje się je w temp. -20 ̊C. Rozkład dNTP jest bardzo często przyczyną braku produktu PCR. Polimeraza DNA: zazwyczaj używana jest 2-3 μ polimerazy Taq na 100 μl mieszaniny reakcyjnej. Wyższe stężenia polimerazy mogą powodować amplifikację produktów niespecyficznych. Jednakże jeśli w mieszaninie reakcyjnej znajduje się inhibitor polimerazy np. matrycowe DNA, jest zanieczyszczona, wówczas wyższe ilości polimerazy (4-6 μ /100 μl) mogą zwiększyć amplifikację. Ze względu na wrażliwość na zamrożenie i odmrożenie zaleca się przechowywanie polimerazy w -20 ̊C oraz wyjmowanie tylko na czas dodania enzymu do reakcji. Bufor do PCR: jego pH w zależności od polimerazy wynosi 8,3-8,8. Stężenie Tris-HCL mieści się w zakresie 10-15 mM. Często zawiera ok. 50 mM KCl,
... zobacz całą notatkę
Komentarze użytkowników (0)