Metody badania kwasów nukleinowych

Nasza ocena:

3
Pobrań: 420
Wyświetleń: 3668
Komentarze: 0
Notatek.pl

Pobierz ten dokument za darmo

Podgląd dokumentu
Metody badania kwasów nukleinowych - strona 1 Metody badania kwasów nukleinowych - strona 2 Metody badania kwasów nukleinowych - strona 3

Fragment notatki:

Metody badania kwasów nukleinowych
Izolacja i oczyszczanie DNA.
Etapy izolacji:
Liza komórek
Denaturacja i hydroliza białek (w tym nukleaz komórkowych)
Usunięcie białek
Zagęszczenie DNA
Procedury izolacji DNA różnią się sposobem usuwania białek.
z zastosowanie fenolu i chloroformu. w skutek wysolenia białek z lizatów komórek
poprzez związanie DNA z nośnikiem, usunięcie zanieczyszczeń i następnie uwolnieniu DNA. Używane są w tym celu kolumny chromatograficzne z filtrami jonowymiennymi lub krzemionkowymi. Metody izolacji RNA
izolacja specyficznego RNA w wyniku frakcjonowania całkowitego RNA komórki.
bezpośrednia izolacja specyficznego RNA ograniczona do komórek syntetyzujących określony RNA w zwiększonej ilości
izolacja poli A(RNA)
izolacja RNA z polirybosomów
izolacja całkowitego RNA komórki, a następnie uzyskanie określonego RNA w formie cDNA w procesie odwrotnej transkrypcji.
Różnice w izolacji RNA w stosunku do DNA:
RNA jest bardziej narażony na degradację niż DNA.
podczas izolacji RNA należy usunąć DNA podczas ekstrakcję fenolem o niskim pH lub trawienie DNA- zą wolną od RNA-z.
Oznaczanie ilości i jakości otrzymanych preparatów kwasów nukleinowych.
Jakość kwasów nukleinowych ocenia się:
w elektroforezie analitycznej na żelu
metodą spektrofotometryczną pomiarów absorbancji.
metodą mikromacierzy w połączeniu z elektroforezą mikrokapilarną.
Pomiar spektrofotometryczny wyizolowanego materiału przeprowadza się przy różnych długościach fali:
240nm
260nm (specyficzna dla kwasów nukleinowych)
280nm (białka)
Na podstawie gęstości optycznej (OD) przy 260 nm oblicza się ilość DNA/RNA, natomiast stosunek OD przy długościach fali 260/280 mówi o jakości preparatu, a stosunek wyników przy długości fal 260/240 nm lub 260/320nm informuje o czystości wyizolowanej próbki . Jeśli stosunek pomiarów przy długości fal 260/280 nm jest większy niż 1,8 to otrzymamy preparat o dobrej jakości.
PCR - łańcuchowa reakcja polimerazy
Denaturacja 93-94 st. przez 30 sekund (1min) - rozdzielenie podwójnej nici DNA na dwie pojedyncze nici. Polimeraza Taq jest odporna na taką temperaturę.
Przyłączanie starterów (annealing), które jest zależne od temperatury. Optymalna temperatura w przedziale 40-60 st. zależy od długości i składu. Wylicza się ze wzoru 2AT+4GC. (45 sek w temp 54 st.)
Elongacja. polimeraza dodaje po jednym nukleotydzie od miejsca przyłączania startera syntetyzując komplementraną kopię matrycy DNA. Temp wzrasta do optymalnej temp dla aktywności polimerazy - 72 st. (2min tylko dNTPs)


(…)

…, fenyloketonurii, hemofilii, mukowiscydozie.
diagnostycznego wykrywania docelowych sekwencji DNA (wykrywania wirusa HIV, prątków gruźlicy)
przeszukiwania genomu pod kątem mutacji, sekwencji powtarzalnych w DNA
w medycynie sądowej do badania znikomych ilości DNA w celu porównania z materiałem genetycznym od poszczególnych podejrzanych.
Problemy z reakcją PCR.
kontaminacja - (zanieczyszczenie próbki) zafałszowanie…
…. Reamplifikacja metoda PCR z wykorzystaniem systemu LightCycler. Im większa temp topnienia tym większa różnica w wielkości mutacji. Tylko potwierdzamy mutacje.
Metoda polimorfizmu konformacji pojedynczej nici DNA SSCP/MSSCP.
Analiza SSCP wykorzystuje zjawisko różnicy w migracji podczas rozdziału elektroforetycznego.
Zdenaturowane produkty amplifikacji w zależności od sekwencji nukleotydowej i temp przyjmują w żelu specyficzną strukturę drugorzędową. Obecność nawet pojedynczej mutacji punktowej w sekwencji nukleotydowej amplifikowanego fragmentu zmienia jego prawidłową konformację i wpływa na szybkość migracji w żelu. W celu zwiększenia czułości metody zastosowano analizę w zmiennej temperaturze (MSSCP).
Metoda ta wykorzystuje fakt, że kilkukrotna zmiana temperatury w czasie elektroforezy zwiększa szansę…
... zobacz całą notatkę

Komentarze użytkowników (0)

Zaloguj się, aby dodać komentarz