To tylko jedna z 3 stron tej notatki. Zaloguj się aby zobaczyć ten dokument.
Zobacz
całą notatkę
Lokalizacja genów
Badania in silico- za pomocą baz danych, oprogramowania, aparte na analizach DNA.
Geny to nie losowa kombinacja NT, posiadają cechy wyróżniające je spośród sekwencji niegenowych.
Podstawowe to: ORF- seria kodonów umożliwiających przyłączanie klejnych AA do tworzonego peptydu. Jej początek to kodon inicjujący ATG, koniec- terminacyjny TAA, TAG, TGA.
Analiza rozpoczyna się od lokalizacji obu kodonów.
Poszukiwania- skanowanie danej sekwencji pod kątem obecności obu kodonów i odpowiedniej odległości między nimi.
Efektywne u bakterii- niewielki % sekwencji nieodujących.
Mniej skuteczny w sekwencjach eukariotycznych- duże regiony pozagenowe plus introny w genach. Geny nie pojawiają się tu jako długie ORF. Wiele eksonów bardzo krótkich (50-100 kodonów).
Nie wszystkie kodony dla danego AA wykorzystywane są w danym gatunku jednakowo często. AA mają swoje preferencje gatunkowe i to wykorzystywane jest przy ukłądanu algorytmów stosowanych do skanowania poznanych sekwencji genomów (np. Leu kodowana przez 6 kodonów, ale u człowieka 1 z nich- CTG preferowany wobec pozostałych 5). Kolejny etap poszukiwać- charakterystyczne połączenia ekson-intron, zwykle AG-GT od strony 5' intronu (od 3' intronu słabo zdefiniowana).
Wykorzystuje się też tzw sekwencje kontrolne położone „powyżej” genów, ale te u Eukaryota są bardziej zmienne niż u Pro i ich stosowanie do lokalizacji genów jest problematyczne.
Metody te dotyczą poszukiwać genów białkowych, nie odnosi się np. do genów RNA- nie mają ORF.
Te tworzą jednak charakterystyczne struktury II-rzędowe. Większośc zawiera struktury typu łodyżki, pętelki (spinki do włosów).
Programy skanujące DNA pod kątem takich struktur identyfikują obszary, w których takie geny są obecne.
Analizy porównawcze- poszukiwanie podobieństw nowej sekwencji do genów już poznanych.
Oceny homologii porównywanych sekwencji (pokrewieństwo ewolucyjne). Ułatwione kiedy znane są sekwencje genomów spokrewnionych gatunków z badanym (wspólny przodek). Analizy obejmują też tzw syntenię- konserwację porządku genów wykazywaną w spokrewnionych genomach.
Metody eskperymantalne:
Większość, inaczej niż w metodach komputerowych, oparta na wykrywaniu i badaniu transkryptów (RNA).
Analizy hybrydyzacyjne:
Northern blots: RNA frakcjonowany w żelu, transferowany na membranę i hybrydyzowany wyzankowamnymi fragmentami genomu (sonda DNA).
Wada: często nie ma możliwości wyizolowania mRNA z całego organizmu (jedynie z narządu, tkanki) więc żaden gen, który nie ulega tam transkrypcji nie zostanie tą drogą wykryty.
(…)
… sekwencje homologiczne wobec sondy obecne są we wszystkich 4 gatunkach ale występują w innym otoczeniu. RACE - szybka amplifikacja końców cDNA (rapie amplification of cDNA ends PCR)
Odmiana PCR, celem jest poznanie dokładnej sekwencji 1 z końców RNA. W zależności od analizowanego końca stosuje się metodę 3'RACE lub 5”RACE
W technice 3'RACE wykorzystywany jest naturalnie występujący wśród wielu mRNA łańcuch…
… powszechnie w wielu różnych mRNA, a celem eksperymentu jest amplifikacja tylko jednego).
Tak otrzymany produkt możemy poddać sekwencjonowaniu.
Nested PCR
Stosowany w celu zwiększenia specyficzności amplifikacji DNA. Dwa zestawy starterów używane w 2 kolejnych reakcjach
W pierwszej reakcji PCR, jedna para zewnętrznych starterów jest używany do tworzenia produktów, które mogą zawierać sekwencje wzmacniane…
… sekwencji NT). Wśród nich:
Ortologi - homologi obecne u różnych organizmów, które przed rozdzieleniem się gatunków miały wspólnego przodka. Geny takie zwykle mają takie same funkcje. Np. gen mioglobiny ludzkiej i szympansa.
Paralogi - obecne w tym samym organizmie (członkowie rodzin wielogenowych), np. gen mioglobiny i beta-globiny człowieka.
Homologia nie równa się podobieństwu (geny…
… inaktywować. Po wprowadzeniu kasety do komórki gospodarza. Między jej końcami a kopią chromosomu zachodzi rekombinacja homologiczna i komórkowa, w których ona zaszła wysiewane są na pożywkę z kanamycyną. Te które rosną mają zniszczony gen docelowy. Badając ich fenotyp uzyskuje się wiedzę o funkcji zniszczonego genu.
Kaseta delecyjna
Stanowi element wektora i składa się z genu oporności na antybiotyk…
... zobacz całą notatkę
Komentarze użytkowników (0)