To tylko jedna z 3 stron tej notatki. Zaloguj się aby zobaczyć ten dokument.
Zobacz
całą notatkę
Hybrydyzacja
Efektywne narzędzie badawcze w diagnostyce molekularnej.
Duża czułość, szerokie spektrum modyfikacji, relatywnie krótki czas.
Technika oparta na tworzeniu stabilnych struktur dwuniciowych z cząsteczek wzajemnie komplementarnych.
Kilkunastonukleotydowe odcinki DNA wystarczają by mogło dojść do utworzenia struktury hybrydowej (tj każda z dwuch nici ma inne pochodzenie).
Stopień „dopasowania” sekwencji nie musi wynosić 100%.
Kompleks taki charakteryzuje się tzw „temperaturą przejścia” powyżej której ulega dysocjacji.
Specyficzność hybrydyzacji zależy od:
Rodzaju sekwencji i składu nukleotydów
Siły jonowej stosowanych buforów (skład- NaCl, SSC, formamid)
Temp (zwykle 42ºC lub 65ºC)
Dobór parametrów metody może prowadzić do hybrydyzacji cząsteczek o różnym stopniu podobieństwa nawet jeśli homologia jest poniżej 50%
Hybrydyzacja- zastosowanie:
Identyfikacja genu w genomowym DNA
Lokalizacja genu (czy dowolnej sekwencji DNA) w komórce/ chromosomie
Informacje o mscu transkrypcji danego genu
Badanie poziomu ekspresji genów
Identyfikacja analogicznych genów w różnych organizmach (stopień wzajemnej homologii)
Wykrywanie mutacji
Ocena liczby kopii danego genu w genomie
Analiza porównawcza wybranych elementów genomu
Identyfikacja określonego typu sekwencji (kodująca/niekodująca)
Zasada technik hybrydyzacyjnych:
Istota zjawiska: wzajemne oddziaływanie między badanym fragmentem kwasu nukleinowego, a soną molekularną (DNA lub RNA z dowolnego org) co prowadzi do utorzenia dupleksu (hybrydu) o ds. strukturze (zasada komplementarności).
Ogrzewanie DNA (90ºC) lub skrajne pH- denaturacja, rozdzielenie nici DNA (zerwanie wiązań H, a nie prowadzi do zerwania wiązań kowalencyjnych).
Odwracając wolno te procesy można doprowadzić do odtworzenia ds. helisy z ss form wobec siebie komplementarnych. Proces taki to hybrydyzacja (renaturacja).
Reakcja może zachodzić między dowolnymi pojedynczymi łańcuchowymi kwasami nukleinowymi: DNA/DNA, RNA/RNA, DNA/RNA.
Warunek: zawierają komplementarne wobec siebie sekwencje.
Sondy molekularne:
Fragment ssNA lub RNA.
W warunkach optymalnych rozpoznaje komplementarne elementy genomu/genu i tworzy z nimi trwałe, ds. struktury.
Wcześniej musi być wyznakowana (radioaktywnie lub nieradioaktywnie), tj związana ze znacznikiem, który umożliwi jej uwidocznienie, a tym samym lokalizację sekwencji do której się przyłączyła.
Sondą może być krótki (20-300nt) lub ługi (kilka-kilkanaście tys NT) odcinek kw nuk, syntetyczny lub naturalny gen lub fragment genu, także całkowity DNA.
(…)
… bezpośrednio na szkiełku mikroskopowym bez transferu na podłoże stałe (membrany). Jedna z odmian- FISH- fluorescencyjna hybrydyzacja in situ. Efekty obserwowane w mikroskopie fluorescencyjnym.
Sondy znakowane znacznikami fluorescencyjnymi.
W eksperymencie można stosować równolegle kilka różnych sond (każda wyznakowana innym znacznikiem).
Komórki w metafazie cyklu komórkowego mają chromosomy w postaci…
… fluorescencyjne- emisja światła o określonej długości fali. Znaczniki- rodamina, kumaryna, fluoresceina. Detekcja przy pomocy mikroskopu fluorescencyjnego.
Metody immunochemiczne, cytochemiczne- do sondy włączany jest nukleotyd sprzężony z haptenem (biotyna, digoksygenina, fluoresceina). Detekcja przy pomocy przeciwciał specyficznych dla danego haptenu.
Enzymatyczne-do sondy włączany nukleotyd sprzężony…
… bezpośrednio na szkiełku mikroskopowym bez transferu na podłoże stałe (membrany). Jedna z odmian- FISH- fluorescencyjna hybrydyzacja in situ. Efekty obserwowane w mikroskopie fluorescencyjnym.
Sondy znakowane znacznikami fluorescencyjnymi.
W eksperymencie można stosować równolegle kilka różnych sond (każda wyznakowana innym znacznikiem).
Komórki w metafazie cyklu komórkowego mają chromosomy w postaci…
... zobacz całą notatkę
Komentarze użytkowników (0)