To tylko jedna z 2 stron tej notatki. Zaloguj się aby zobaczyć ten dokument.
Zobacz
całą notatkę
Enzymy restrykcyjne w analizie DNA Zmiany które zaszły w ostatnich latach w badaniach biologicznych bezpośrednio związane są z możliwościami manipulowania cząsteczką DNA. Głównym narzędziem inżynierii genetycznej stały się enzymy katalizujące specyficzne reakcje w DNA. Dzięki nim stało się możliwe wykorzystanie takich technik jak mapowanie, znakowanie kwasów nukleinowych czy też konstrukcja hybrydowych cząsteczek DNA.
Odkrycie enzymów restrykcyjnych stało się przełomowym momentem w rozwoju technologii rekombinacji DNA. Pierwszym wyizolowanym enzymem restrykcyjnym był HindII (1970r).
Nazwy poszczególnych enzymów składają się z dwóch lub trzech członów i obejmują: trzyliterowy symbol informuje o bakterii, z której uzyskano enzym, dodatkową literę informującą o szczepie lub serotypie bakterii (np. BamHI), rzymską liczbę wskazującą na serię enzymu z danego organizmu. Najważniejszą cechą enzymów restrykcyjnych jest fakt rozpoznawania przez nie specyficznych sekwencji w obrębie dwuniciowego DNA, co w efekcie końcowym prowadzi do powstanie ściśle określonych fragmentów DNA zarówno pod względem długości jak i posiadanych końców. Wszystkie enzymy są częścią systemu opierającego się na restrykcji-metylacji, odgrywającego ważną rolę w ochronie komórki bakteryjnej przed inwazją obcego DNA. Protekcja ta polega na modyfikacji własnego DNA poprzez obecność N6-metyloadeniny lub 5-metylocytozyny.
Enzymy restrykcyjne są endodeoksyrybonukeazami, które hydrolizują DNA po rozpoznaniu specyficznych sekwencji nukleotydowych poprzez zerwanie dwóch wiązań fosfodiestrowych ( po jednym na każdej nici dupleksu DNA).
Dotychczas wyizolowane enzymy restrykcyjne sklasyfikowano w 3 podstawowe grupy według mechanizmu działania, składu podjednostek, substratów, produktów i kofaktorów katalizowanego przez nie procesu. Endonukleazy klasy I i III wykazują szereg podobieństw. Enzymy klasy I są najbardziej skomplikowane, zawierają trzy typy różnych podjednostek, posiadają aktywność nukleazy i metylazy, efektywność ich działania uzależniona jest od obecności ATP, S-adenozylometioniny i jonów Mg2+ jako kofaktorów. Enzym rozpoznaje określoną ie zmetylowaną sekwencje w obrębie dwuniciowego DNA i w pewnej odległości od niej hydrolizuje obie nici. Enzymy klasy III zawierają tylko dwa typy podjednostek, podobnie jak opisane enzymy klasy I wymagają obecności ATP i jonów MG2+, zaś obecność S-adenozylometioniny nie jest konieczna, choć wzmaga ich aktywność. Enzymy te również hydrolizują nie zmetylowane nici DNA w pewnej odległości choć odległość ta jest bardziej sprecyzowana i wynosi średnio 25 nukleotydów. Enzymy kasy II stanowią najprostszy system enzymów złożonych z jednego typu podjednostek i aktywowanych jedynie obecnością jonów Mg2+ jako kofaktora. Endonukeazy te hydrolizują dwuniciowy DNA lecz w obrębie rozpoznawanej przez nie sekwencji. Sekwencja ta zazwyczaj ma postać palindromu i liczy 4-8 par zasad. Enzymy te nie są związane z metylazami. Metylazy są kodowane przez odrębne geny a łączy się je z restryktazami ponieważ poznają i modyfikują te same sekwencje DNA. DNA metylowany w takiej sekwencji jest oporny na działanie odpowiedniej restryktazy, co w warunkach in vitro chroni własny DNA bakterii przed endogennym enzymem restrykcyjnym.
(…)
….
Bezpośrednie zastosowanie w biologii molekularnej znalazły jedynie enzymy klasy II. Wynika to z ich właściwości do hydrolizy w określonej pozycji wynikającej ze ściśle określonej sekwencji nukleotydów i tworzenia kompatybilnych końców. Ponadto produktem ich działania na substraty DNA jest fragment o zidentyfikowanej długości, łatwy do rozdzielenia i identyfikacji.
Ogólnie ujmując różne enzymy restrykcyjne…
… samych lepkich końcach (np. BamHI i SauAI).
Enzymy restrykcyjne są białkami dość stabilnymi i jak każdy enzym wymagają ściśle kreślonych warunków do osiągnięcia maksymalnej aktywności. Większość jest aktywna w zakresie pH 7,2-7,6. Większość enzymów rutynowo działa w temp. 37'C, niektóre jednak wymagają wyższej lub niższej temperatury. Główne różnice obejmują optymalną siłę jonową buforu ( stężenie soli…
... zobacz całą notatkę
Komentarze użytkowników (0)