To tylko jedna z 49 stron tej notatki. Zaloguj się aby zobaczyć ten dokument.
Zobacz
całą notatkę
BIOCHEMIA
Wykład 5: Poznawanie genów i genomów
Joanna Cieśla
Podstawowe narzędzia
wykorzystywane w poznawaniu genów
1. Analiza restrykcyjna
2. Techniki hybrydyzacyjne
3. Technologia rekombinacji DNA
4. Sekwencjonowanie DNA
5. Chemiczna synteza kwasów nukleinowych na stałym
podłożu
6. Łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR)
7. Komputer
Analiza restrykcyjna
Enzymy restrykcyjne (endonukleazy restrykcyjne) rozpoznają
specyficzne sekwencje w dwuniciowej helisie DNA (4-8 par zasad)
i rozcinają obie nici w ściśle określonych miejscach.
1978 r. – Nagroda Nobla dla
Wernera Arbera, Hamiltona
Smitha i Daniela Nathansa za
odkrycie enzymów restrykcyjnych
oś symetrii
Sekwencje rozpoznawane przez enzymy
restrykcyjne mają podwójną symetrię obrotową –
są palindromami.
Oczyszczono i scharakteryzowano po nad 100
enzymów restrykcyjnych.
Zastosowanie enzymów restrykcyjnych
Rozcinanie DNA na specyficzne fragmenty. Obraz fragmentów
rozdzielonych w żelu stanowi "odcisk palca" cząsteczki DNA
(ang. DNA fingerprint).
Sporządzanie map chromosomów
Uzyskiwanie rekombinowanego DNA – klonowanie
Nazwy są skrótami od nazwy łacińskiej organizmu, z którego pochodzą,
litera oznacza szczep, a cyfra rzymska numer wyizolowanego enzymu:
•BamH I - pierwszy enzym wyizolowany z Bacillus amyloliquefaciens szczepu H.
•Sma I
- pierwszy enzym wyizolowany z Serratia marcescens szczepu Sb
(nazwa szczepu została pominięta w nazwie enzymu).
•NgoM IV - czwarty enzym wyizolowany z Neisseria gonorrhoeae szczepu MS11.
•Sex I
- enzym wyizolowany z Streptomyces exfoliatus.
•Uba 58 I - enzym wyizolowany z niezidentyfikowanej bakterii (Unidentified
bacterium) RFL58.
Elektroforeza żelowa kwasów
nukleinowych
Ruchliwość elektroforetyczna fragmentu DNA w różnych
typach żeli jest w pewnych granicach odwrotnie
proporcjonalna do logarytmu długości tego fragmentu
(wyrażanej liczbą par zasad).
Stężenie
agarozy
(%)
Długość
rozdzielanego
liniowego DNA (kpz)
0.3
0.6
0.7
0.9
1.2
1.5
2.0
5-60
1-20
0.8-10
0.5-7
0.4-6
0.2-3
0.1-2
Żele poliakryloamidowe są
używane do rozdzielania
fragmentów o długości do
1000 pz.
Duże fragmenty DNA można
rozdzielać na żelach
agarozowych o różnym
stężeniu.
Obraz elektroforezy
żelowej po trawieniu DNA
wirusa SV40 trzema
różnymi enzymami
restrykcyjnym
Przygotowanie żelu agarozowego
Barwniki (bromophenol blue, xylene cyanol,
orange G), dodawane do próbek nakładanych
na żel, służą do monitorowania przebiegu
elektroforezy.
DNA można uwidaczniać za pomocą barwienia bromkiem etydyny, a
znakowany radioaktywnie DNA za pomocą autoradiografii.
Bromek etydyny
Elektroforeza w pulsującym polu elektrycznym
(PFGE, ang. pulsed field electrophoresis)
pozwala na rozdzielanie całych chromosomów,
zawierających miliony nukleotydów.
Hybrydyzacja kwasów nukleinowych
Technika Southerna (DNA-DNA) polega na przeniesieniu
na błonę rozdzielonych w żelu fragmentów DNA i
hybrydyzacji z wyznakowaną sondą – komplementarnym
fragmentem jednoniciowego kwasu nukleinowego
Edwin Southern
Technika
... zobacz całą notatkę
Komentarze użytkowników (0)