To tylko jedna z 4 stron tej notatki. Zaloguj się aby zobaczyć ten dokument.
Zobacz
całą notatkę
Ćwiczenie 4. Rozdział elektroforetyczny na żelu agarozowym Elektroforeza na żelu agarozowym lub poliakrylamidowym jest standardową metodą używaną do rozdziału oraz identyfikowania fragmentów DNA, działającą na zasadzie sita molekularnego. Podłączenie do prądu stałego powoduje powstanie pola elektrycznego na całości żelu. Podczas elektroforezy, stężony żel (nośnik) umieszczony jest w buforze, który charakteryzuje się dużym przewodnictwem i zapewnia odpowiednie pH (bliskie neutralnego) zabezpieczające DNA przed degradacją. Cząsteczki DNA obdarzone są ładunkiem ujemnym i dlatego migrują w kierunku bieguna dodatniego. Rozdział następuje więc na podstawie masy odpowiednich fragmentów, co pozwala na ustalenie ich wielkości, degradacji izolatu oraz określenie ewentualnych zanieczyszczeń. Szybkość migracji fragmentów kwasów nukleinowych w nośniku zależy od ich długości oraz jest odwrotnie proporcjonalna do ich mas cząsteczkowych – im krótsze, czyli lżejsze, tym szybciej migrują. Podobnie jak pokonana przez cząsteczki odległość od kieszonki, najbliżej wędruje wysokocząsteczkowy DNA, natomiast najdalej jego najkrótsze fragmenty. Żel działa na zasadzie sita molekularnego opóźniającego przejście większych molekuł. Żel agarozowy jest lepszym sitem dla dużych cząstek, większych niż kilkaset nukleotydów. Żel poliakrylamidowy bardziej nadaje się do frakcjonowania małych molekuł i pozwala rozróżniać fragmenty DNA, które różnią się wielkością nawet jednego nukleotydu. Na zajęciach zostanie wykorzystany żel agarozowy. Agaroza to frakcja agaru pochodzącego z krasnorostów. Komercyjna agaroza ma postać proszku łatwo rozpuszczającego się w buforze. Stosując różne stężenia roztworów agarozy można regulować porowatość żelu, a przez to stopień rozdziału w zależności od rozmiaru rozdzielanych cząstek. Przed nałożeniem produktu PCR na żel, próby wymieszane są z buforem obciążającym oraz z roztworem barwnika. Dzięki temu, wzrasta gęstość próby gwarantując, że krople DNA zostaną równo umieszczone w kieszonce oraz możliwe jest monitorowanie przebiegu rozdziału molekuł w żelu. Do jednej kieszonki nakładana jest mieszanina fragmentów DNA o znanej długości tzw. Drabinka (marker wielkości), umożliwiająca określanie wielkości badanego produktu. Wizualizacja obrazu
(…)
… obciążający z roztworem barwnika
- wyizolowane DNA z poprzednich ćwiczeń
- pipety P-2, P-10, P-20
- końcówki do pipet P-2, P-10, P-20
- pojemnik na odpady
- rękawiczki laboratoryjne
Procedura
przygotowanie 1,5% żelu agarozowego
1. Przygotować formę do wylania żelu agarozowego i umieścić ją w zacisku.
2. Naważyć 0,75g agarozy, dodać 50 ml buforu TBE.
3. Podgrzewać roztwór w kuchence mikrofalowej…
… dejonizowana
- bufor dla enzymu restrykcyjnego (10X)
- enzym restrykcyjny – na zajęciach użyty zostanie Hinf I (10-20U)
- pipety P-2, P-20
- końcówki do pipet P-2, P-20
- marker laboratoryjny
- pojemnik na odpady
- rękawiczki laboratoryjne
Zanim przystąpisz do przygotowania reakcji PCR:
Każdy odczynnik (z wyjątkiem enzymu restrykcyjnego) przed dodaniem do mieszaniny należy rozmrozić,
dobrze wymieszać…
… powietrza?
2. W jakim celu używany jest standard wielkości?
3. Jakie są różnice między żelem agarozowym a poliakrylamidowym?
Ćwiczenie 5. Trawienie enzymem restrykcyjnym
Enzymy restrykcyjne (ang. restriction enzymes), są to enzymy z grupy endonukleaz przecinające
dwuniciową cząsteczkę DNA w miejscu wyznaczanym przez specyficzną sekwencję DNA. Naturalnie
występują u bakterii i sinic, u których pełnią funkcję mechanizmu obronnego (system restrykcji-metylacji).
Zapobiega on wnikaniu obcego DNA do genomu bakterii oraz zabezpiecza komórkę przed trawieniem
własnego DNA. Po raz pierwszy enzym restrykcyjny został wyizolowany w 1968 roku, ze szczepu bakterii
Escherichia Coli. Ważną cechą produktów powstałych w wyniku trawienia DNA enzymami restrykcyjnymi
jest to, że otrzymywane fragmenty DNA można rozdzielić na żelach w procesie elektroforezy. W ten sposób
otrzymujemy obraz prążków w żelu. W poszczególnych prążkach znajdują się cząsteczki DNA o
identycznej sekwencji nukleotydowej. Analizując na żelach produkty trawienia danego DNA różnymi
enzymami restrykcyjnymi można ustalić wzajemne położenie i odległości pomiędzy sekwencjami
rozpoznawanymi przez te enzymy.
Obecnie znanych jest bardzo dużo enzymów…
... zobacz całą notatkę
Komentarze użytkowników (0)