Ćwiczenia 4: Rozdział elektroforetyczny na żelu agarozowym

Nasza ocena:

5
Pobrań: 329
Wyświetleń: 1540
Komentarze: 0
Notatek.pl

Pobierz ten dokument za darmo

Podgląd dokumentu
Ćwiczenia 4: Rozdział elektroforetyczny na żelu agarozowym - strona 1 Ćwiczenia 4: Rozdział elektroforetyczny na żelu agarozowym - strona 2 Ćwiczenia 4: Rozdział elektroforetyczny na żelu agarozowym - strona 3

Fragment notatki:


Ćwiczenie 4. Rozdział elektroforetyczny na żelu agarozowym Elektroforeza na żelu agarozowym lub poliakrylamidowym jest standardową metodą używaną do  rozdziału oraz identyfikowania fragmentów DNA, działającą na zasadzie sita molekularnego. Podłączenie  do prądu stałego powoduje powstanie pola elektrycznego na całości żelu. Podczas elektroforezy, stężony żel  (nośnik)   umieszczony   jest   w   buforze,   który   charakteryzuje   się   dużym   przewodnictwem   i   zapewnia  odpowiednie pH (bliskie neutralnego) zabezpieczające DNA przed degradacją. Cząsteczki DNA obdarzone  są  ładunkiem   ujemnym  i  dlatego   migrują   w  kierunku  bieguna  dodatniego.   Rozdział   następuje więc  na  podstawie masy odpowiednich fragmentów, co pozwala na ustalenie ich wielkości, degradacji izolatu oraz  określenie ewentualnych zanieczyszczeń. Szybkość migracji fragmentów kwasów nukleinowych w nośniku  zależy od ich długości oraz jest odwrotnie proporcjonalna do ich mas cząsteczkowych – im krótsze, czyli  lżejsze, tym szybciej migrują. Podobnie jak pokonana przez cząsteczki odległość od kieszonki, najbliżej  wędruje wysokocząsteczkowy DNA, natomiast najdalej jego najkrótsze fragmenty. Żel działa na zasadzie  sita   molekularnego   opóźniającego   przejście   większych   molekuł.   Żel   agarozowy   jest   lepszym   sitem   dla  dużych   cząstek,   większych   niż   kilkaset   nukleotydów.   Żel   poliakrylamidowy   bardziej   nadaje   się   do  frakcjonowania małych molekuł i pozwala rozróżniać fragmenty DNA, które różnią się wielkością nawet  jednego nukleotydu.  Na   zajęciach   zostanie   wykorzystany   żel   agarozowy.   Agaroza   to   frakcja   agaru   pochodzącego   z  krasnorostów. Komercyjna   agaroza  ma   postać   proszku  łatwo  rozpuszczającego   się w buforze.  Stosując  różne   stężenia   roztworów   agarozy   można   regulować   porowatość   żelu,   a   przez   to   stopień   rozdziału   w  zależności od rozmiaru rozdzielanych cząstek. Przed nałożeniem produktu PCR na żel, próby wymieszane  są z buforem obciążającym oraz z roztworem barwnika. Dzięki temu, wzrasta gęstość próby gwarantując, że  krople DNA zostaną równo umieszczone w kieszonce oraz możliwe jest monitorowanie przebiegu rozdziału  molekuł w żelu. Do jednej kieszonki nakładana jest mieszanina fragmentów DNA o znanej długości tzw.  Drabinka (marker wielkości), umożliwiająca określanie wielkości badanego produktu. Wizualizacja obrazu 

(…)

… obciążający z roztworem barwnika
- wyizolowane DNA z poprzednich ćwiczeń
- pipety P-2, P-10, P-20
- końcówki do pipet P-2, P-10, P-20
- pojemnik na odpady
- rękawiczki laboratoryjne
Procedura
 przygotowanie 1,5% żelu agarozowego
1. Przygotować formę do wylania żelu agarozowego i umieścić ją w zacisku.
2. Naważyć 0,75g agarozy, dodać 50 ml buforu TBE.
3. Podgrzewać roztwór w kuchence mikrofalowej
… dejonizowana
- bufor dla enzymu restrykcyjnego (10X)
- enzym restrykcyjny – na zajęciach użyty zostanie Hinf I (10-20U)
- pipety P-2, P-20
- końcówki do pipet P-2, P-20
- marker laboratoryjny
- pojemnik na odpady
- rękawiczki laboratoryjne
Zanim przystąpisz do przygotowania reakcji PCR:
Każdy odczynnik (z wyjątkiem enzymu restrykcyjnego) przed dodaniem do mieszaniny należy rozmrozić,
dobrze wymieszać…
… powietrza?
2. W jakim celu używany jest standard wielkości?
3. Jakie są różnice między żelem agarozowym a poliakrylamidowym?
Ćwiczenie 5. Trawienie enzymem restrykcyjnym
Enzymy restrykcyjne (ang. restriction enzymes), są to enzymy z grupy endonukleaz przecinające
dwuniciową cząsteczkę DNA w miejscu wyznaczanym przez specyficzną sekwencję DNA. Naturalnie
występują u bakterii i sinic, u których pełnią funkcję mechanizmu obronnego (system restrykcji-metylacji).
Zapobiega on wnikaniu obcego DNA do genomu bakterii oraz zabezpiecza komórkę przed trawieniem
własnego DNA. Po raz pierwszy enzym restrykcyjny został wyizolowany w 1968 roku, ze szczepu bakterii
Escherichia Coli. Ważną cechą produktów powstałych w wyniku trawienia DNA enzymami restrykcyjnymi
jest to, że otrzymywane fragmenty DNA można rozdzielić na żelach w procesie elektroforezy. W ten sposób
otrzymujemy obraz prążków w żelu. W poszczególnych prążkach znajdują się cząsteczki DNA o
identycznej sekwencji nukleotydowej. Analizując na żelach produkty trawienia danego DNA różnymi
enzymami restrykcyjnymi można ustalić wzajemne położenie i odległości pomiędzy sekwencjami
rozpoznawanymi przez te enzymy.
Obecnie znanych jest bardzo dużo enzymów…
... zobacz całą notatkę

Komentarze użytkowników (0)

Zaloguj się, aby dodać komentarz