Kariotypowanie elektroforetyczne - omówienie

Nasza ocena:

3
Pobrań: 98
Wyświetleń: 1722
Komentarze: 0
Notatek.pl

Pobierz ten dokument za darmo

Podgląd dokumentu
 Kariotypowanie elektroforetyczne - omówienie - strona 1  Kariotypowanie elektroforetyczne - omówienie - strona 2

Fragment notatki:

Kariotypowanie elektroforetyczne
1. Kariotypowanie
Oznaczanie liczby chromosomów i ich rozmiarów
Oznaczenia takie potwierdza się badaniami cytologicznymi.
Grzyby niedoskonałe:
Głównie w stosunku do nich stosowane jest kariotypowanie
Nie mają zdolności reprodukcji seksualnej, więc wszystkie badania prowadzono stosując rekombinacje mitotyczne.
Fragmenty powyżej 30kb nie poruszają się w standardowym żelu agarozowym. Chromosomy są większe niż 30kb.
2. Elektroforeza:
Cząsteczki DNA ujemnie naładowane migrują pod wpływem pola elektrycznego w kierunku +
Małe DNA migrują szybciej w żelu niż cząstki długie
Opis metody:
Próbkę nakładamy na żel agarozowy
Przykładamy napięcie elektryczne
Cząsteczki od - migrują do +.
2.1 Elektroforeza pulsacyjna (OFAGE): 1984 Schwarz i Cantor- technika OFAGE.
Umożliwiła rozdzielenie cząsteczek DNA większych od 2Mb.
Opis metody:
Wykorzystuje się 4 elektrody: dwie elektrody naprzeciw siebie
Cząsteczki DNA zmieniają swoje położenie przy każdej zmianie pola elektrycznego.
Raz wędrują od jednej pary naprzeciwległych elektrod potem od drugiej pary - w ten sposób cząstki DNA idą skokowo, to pozwala na dobry rozdział materiału
Czas reorientacji (czas zmiany elektrod, przez które płynie napięcie) zależy od rozmiaru cząstki DNA, co pozwala na rozdzielenie całych chromosomów.
2.2 PFGE:
Umożliwia rozdział DNA większych od 10Mb.
Opis metody:
Protoplasty grzybów
Robimy bloczki agarozowe (sześciany) z DNA
Te sześciany poddajemy obróbce, np. przemywanie, trawienie enzymami restrykcyjnymi
Bloczki agarozowe wkładamy do odpowiednich dołków
Puszczamy elektroforezę
Zdjęcie żelu i analiza danych
Rozmiar i liczba chromosomów różnią się u różnych gatunków i mogą być wykorzystywane do identyfikacji szczepu.
Kariotypowanie obejmuje także:
1) Użycie niektórych rzadkich enzymów restrykcyjnych - opracowanie map restrykcyjnych
2) Southern blot umożliwia tworzenie grup sprzężeń
3) Analiza YACs
Ważnym parametrem wpływającym na rozdział jest czas reorientacji:
Rozdział chromosomów S.cerevisiae (0,2-2,2 Mb) - wymagany jest czas pulsacji 60-120 sek (przez 2 min jeden puls, a potem przez kolejne 2 min drugi puls)
Chromosomy wielkości powyżej 6 Mb - czas pulsacji dłuższy niż 3h połączony z zastosowaniem niższych napięć


(…)

…-2,2 Mb) - wymagany jest czas pulsacji 60-120 sek (przez 2 min jeden puls, a potem przez kolejne 2 min drugi puls)
Chromosomy wielkości powyżej 6 Mb - czas pulsacji dłuższy niż 3h połączony z zastosowaniem niższych napięć
2.3 Połączenie PFGE i mikroskopii fluorescencyjnej pozwala na wizualizację cząstek DNA w czasie elektroforezy (barwienie fluorescencyjnym barwnikiem np.: SALTO)
Po zakończonej PFGE…
... zobacz całą notatkę

Komentarze użytkowników (0)

Zaloguj się, aby dodać komentarz