To tylko jedna z 5 stron tej notatki. Zaloguj się aby zobaczyć ten dokument.
Zobacz
całą notatkę
Rozdział chromosomów grzybowych:
Kariotypowanie elektroforetyczne zależy od:
Izolacji odpowiedniej liczby nienaruszonych protoplastów
Odpowiednich warunków elektroforezy, w celu rozdzielenia chromosomów
Strzępka --- protoplast --- wkładamy bloczek agarozowy --- elektrogoreza
3.1 Kariotypy grzybów dzielimy na 2 grupy:
1) Yeast-like Zawierają chromosomy od 200-2000kb.
Rozdział elektroforetyczny: czas pulsacji od 1 do kilku minut.
Całkowity czas elektroforezy 20-24h
2) S.pombe-like
Chromosomy 2-8Mb
Wydłużony czas pulsacji (30-180 min)
Elektroforeza 5-14 dni
To co przeszkadza w elektroforezie i oznaczaniu to:
Mitochondrialne DNA Może być obecne w żelach PFGE i fałszować otrzymane wyniki.
Rozmiar grzybowego mtDNA wynosi 16-149 kb, a jego mobilność jest niezależna od rozmiaru.
A.chrysogenum: mtDNA 27 kb, migruje razem z cząstkami liniowymi 1,8-1,9 Mb.
4. CLPs - polimorfizm długości chromosomów:
CLPs- polimorfizm długości chromosomów:
Cecha charakterystyczna dla danego grzyba
Różnice w ilości i wielkości chromosomów są powszechnie wykorzystywane w badaniach taksonomicznych poszczególnych gatunków lub izolatów.
CLPs pozwala na:
1) Proste rozróżnienie poszczególnych organizmów
2) Opisany u wielu organizmów grzybowych (S.cerevisiae, S.commune, C.albicans, L.maculans)
3) Może być powiązany z rearanżacjami chromosomowymi, indukowanymi na drodze mutagenizacji, spontaniczne mutacje lub transformacje.
W przypadku poszczególnych mutantów, wykryto, iż różne kariotypy elektroforetyczne odpowiadają zmianom długości chromosomów, powstawaniem ploidów i translokacjami.
Zastosowanie CLPs:
1) Acremonium chrysogenum
Szczepy produkujące cefalosporynę C (otrzymano przez mutagenizację chemiczną lub UV) wykazywały CLPs.
Analiza Southern- wykazano, że geny cefalosporyn położone są na zmodyfikowanych chromosomach i zmiany strukturalne świadczą o różnej zdolności tych szczepów do produkcji cefalosporyn.
2) Penicillium chrysogenum:
Szczepy otrzymano przez mutagenizację UV wykazywały amplifikacje (powielenie genu) i translokacje wewnątrz genów penicyliny.
Translokacje - zmiana rozmiaru chromosomu o ok. 100 kb (taka zmiana widoczna w elektroforezie pulsacyjnej).
Kariotypy grzybów fitopatogennych:
Do identyfikacji szczepów wykorzystywane są 3 techniki:
(…)
… samoreplikujące plazmidy zostały poznane (u grzybów nie ma przeważnie plazmidów).
Badanie miejsca położenia transformowanego DNA:
DNA genomowe:
Trawione enzymami restrykcyjnymi PFGE
Nie-trawione enzymami restrykcyjnymi PFGE
Hybrydyzacja Southern rozdzielonych chromosomów pozwala na lokalizację zrekombinowanego DNA
Duża liczba zintegrowanych kopii wektora prowadzi do wzrostu w obecności chromosomu.
Izolacja…
… chromosomie (bo muszą być miejsca homologiczne).
7.2 B. Analizy restrykcyjne
Tworzenie map restrykcyjnych Rzadko tnące enzymy restrykcyjne są stosowane:
BglI
PacI
I-SceI
NotI (mapa restrykcyjna S.pombe)
Rozdzielenie chromosomów współidących
1) W 1993 opisano mapę fizyczną S.cerevisiae dla chromosomu I wykorzystując I-SceI
2) Transferazy metylowe DNA (Mtazy), metylacja kompletnego genomu poza 1 miejscem…
... zobacz całą notatkę
Komentarze użytkowników (0)