To tylko jedna z 6 stron tej notatki. Zaloguj się aby zobaczyć ten dokument.
Zobacz
całą notatkę
Elektroforeza agarozowa plazmidowego DNA. Ocena stężenia i czystości izolatu. 1.Wstęp teoretyczny Elektroforeza jest techniką rozdziału wykorzystującą zjawisko migracji cząsteczek w polu elektrycznym. Kwasy nukleinowe są ujemnie naładowane więc migrują od anody do katody. Poruszające się cząsteczki DNA mają różną długość szybkość ich wędrówki poprzez żel jest różna. Jest to także zależne od przyłożonego napięcia oraz porowatości nośnika (żelu) w którym zachodzi rozdział. Pozwala to na analizę jakościową ekstraktów genomowego DNA. Do rozdziału dużych cząsteczek kwasów nukleinowych (np. genomowego DNA) jako nośnik często stosuje się żel agarozowy. Po przeprowadzeniu elektroforezy, prążki DNA uwidacznia się to w postaci prążków za pomocą Gel-Red jest to barwnik, który interkaluje między zasady) widocznych w UV. Elektroforezę agarozową wykonuje się najczęściej po reakcji PCR, aby na żelu uwidocznić jej produkty w obecności markera wielkości. Żel agarozowy może mieć różne stężenie ale najczęściej dla plazmidowego DNA jest to 1,2% Ocenę stężenia czystości i stężenia DNA można określić przy pomocy pomiaru absorpcji światła UV lub przez wybarwienie preparatu bromkiem etydyny, wykonanie elektroforezy w żelu agarozowym i porównanie fluorescencji z preparatem o znanym stężeniu. Do pomiaru absorpcji preparaty muszą być rozcieńczone 100X wodą destylowaną bądź buforem TE. Do kalibracji należy użyć tego samego buforu w którym rozcieńczono preparaty .Po kalibracji odczytuje się punktowe wartości absorpcji przy 260,280,320 nm lub wykonuje się widmo w zakresie 200-350nm.
Marker Lambda- Puc Marker,4
2.Przebieg ćwiczenia: Przygotowanie żelu agarozowego: W kolbce Erlenmeyer'a przygotowaliśmy 50ml buforu TBE (Tris/Kwas Borowy/EDTA) 1x korzystając z roztworu wyjściowego o stężeniu 5x. Odważyć odpowiednią ilość agarozy(0,5g) do uzyskania 1% żelu, wsypaliśmy do buforu, wrzuciliśmy mieszadełko, kolbę nakryliśmy kawałkiem folii aluminiowej i ogrzewaliśmy.
Przygotowaliśmy aparat do elektroforezy. Włożyliśmy saneczki oraz przekładki po obu stronach żelu, lekko docisnęliśmy, aby połączenie było szczelne, założyliśmy grzebień ok. 1 cm od jednego z końców żelu. Po całkowitym rozpuszczeniu agarozy wystudziliśmy roztwór do ok. 50°C, dodaliśmy ostrożnie 5µl barwnika GelRed™ (1000x).
Lekko wystudzony żel wlaliśmy powoli do aparatu, uważając, aby nie powstały pęcherze powietrza (szczególnie w okolicy grzebienia).
Żel pozostawićliśmy do stężenia na ok. 20 min. Przygotowanie i nałożenie próbek - plazmidowego DNA ekstrahowanego metodą mini-prep (30 µl) z poprzedniego ćwiczenia (spodziewana długość produktu :3261):
(…)
… na 1cm długości żelu), tj. około 100-120V.
Przerwaliśmy rozdział, gdy barwnik (błękit bromofenolowy) osiągnie około 4/5 długości żelu.
Po tym czasie żel umieściliśmy na iluminatorze UV 254.
Spektrofotometryczna ocena stężenia i czystości izolatu:
Wykonaliśmy rozcieńczenie próbki plazmidowego DNA 1 : 99 µl wody.
Wprowadziliśmy wartość rozcieńczenia i wykalibrowaliśmy aparat przy użyciu wody naciskając…
… pozostawićliśmy do stężenia na ok. 20 min. Przygotowanie i nałożenie próbek - plazmidowego DNA ekstrahowanego metodą mini-prep (30 µl) z poprzedniego ćwiczenia (spodziewana długość produktu :3261):
Próbki wstrząsnąć a następnie krótko zwirowaliśmy, pobraliśmy 1µl. Dodaliśmy 4 µl wody.
Do każdej probówki dodaliśmy 6x buforu obciążającego (końcowe stężenie 1x).
Żel w aparacie zalaliśmy buforem do elektroforezy TBE…
... zobacz całą notatkę
Komentarze użytkowników (0)