To tylko jedna z 4 stron tej notatki. Zaloguj się aby zobaczyć ten dokument.
Zobacz
całą notatkę
Weryfikacja wyników klonowania, izolacja wektora plazmidowego do transfekcji
1. Strategie szybkiej weryfikacji wyników klonowania: blue/ white screening, toothpick lysis, colony PCR (cele i zasady metody).
I Blue/ white screening
W celu odróżnienia bakterii, które pobrały plazmid bez wstawki, od tych, które otrzymały plazmid zrekombinowany, czyli zawierający wstawkę stosuje się marker- ß-galaktozydazę.
Na wektorze, w miejscu MCS znajduje się N-końcowy fragment genu lacZ kodującego ten enzym (nazywany fragmentem Z' lub α) wraz z sekwencją promotorową, a w genomie biorcy znajduje się część C-końcowa wraz z sekwencjami niezbędnymi dla jej ekspresji. Po wprowadzeniu plazmidu do komórki biorcy produkty białkowe obydwu fragmentów genu lacZ łączą się tworząc funkcjonalny enzym. Jest to tak zwana α-komplementacja. Jeśli w obrębie fragmentu Z' wstawiony zostanie odcinek DNA- wstawka, w komórce nie będzie powstawał aktywny enzym. Obecność ß-galaktozydazy wykrywa się w komórkach poprzez dodanie do podłoża X-gal, który po rozkładzie przez ß-galaktozydazę przyjmuje niebieskie zabarwienie. X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolylo-beta-D-galaktopiranozy)- nieindukcyjny, barwny substrat, używany najczęściej w połączeniu z IPTG w screeningu kolonii białe/niebieskie do detekcji rekombinantów. Tak więc, po wysianiu stransformowanych bakterii na podłoże z X-gal niebieskie zabarwienie przyjmą kolonie powstałe z komórek zawierających pusty wektor, a kolonie niezabarwione będą posiadały plazmidy ze wstawkami.
II Metoda toothpick lysis (metoda wykałaczki)
Zastosowanie: identyfikacjia kolonii bakterii zawierających plazmidy zrekombinowane po transformacji
otrzymanie przybliżonej wielkości insertu/wstawki, plazmidu/wektora
Bufor do lizy TLB (toothpick lysis buffer):
1) NaOH- denaturacja białek i DNA
2) SDS- denaturacja białek, liza komórek bakteryjnych, uwolnienie materiału genetycznego
3) EDTA pH 8,0
4) Ficoll- czynnik obciążający, syntetyczny hydrofilowy polimer cukrowy, ma wpływ na ciśnienie osmotyczne
5) błekit bromofenolowy- składnik obciążający, służy też zabarwieniu próbki- możliwość obserwacji przebiegu elektroforezy
6) woda
Przechowujemy w temp -20°C w porcjach 1ml. Może być wielokrotnie rozmrażane bez szkód.
1) Przygotować płytkę wzorcową (master plate) z podłożem stałym zawierającą czynnik selekcyjny- antybiotyk- ampicylina (LB-Amp)
2) Przygotowanie probówek z TLB
3) Sterylną wykałaczką pobrać transformowaną kolonie
4) Przenieść w postaci kreski na master plate, a resztę strącić do probówki z TLB (zawiesić)
(…)
… w celu oddzielenia struktur subkomórkowych, rozdzielenia biopolimerów czy oznaczania masy cząsteczkowej. Separacja DNA plazmidowego od chromosomowego polega na zróżnicowanym stopniu inkorporacji bromku etydyny przez koliste plazmidowe formy i liniowe chromosomowe cząsteczki DNA, co prowadzi do zróżnicowania ich gęstości pławnej umożliwiając rozdział w gradiencie.
3) Oczyszczanie na minikolumnach- wysoka…
... zobacz całą notatkę
Komentarze użytkowników (0)