To tylko jedna z 20 stron tej notatki. Zaloguj się aby zobaczyć ten dokument.
Zobacz
całą notatkę
Zakład Biologii Molekularnej Roślin
Uniwersytet Warszawski
Instytut Biochemii i Biofizyki PAN
BIOLOGIA MOLEKULARNA ROŚLIN
Skrypt do ćwiczeń
Warszawa, 2006
Spis Treści
1. Analiza zmian na poziomie chromatyny w cyklu komórkowym............................3
Izolacja białek z materiału roślinnego . ..........................................................................................4
Elektroforeza białek w żelu poliakrylamidowym w obecności SDS.............................................5
Przygotowanie żelu do SDS PAGE...........................................................................................6
Elektroforeza ............................................................................................................................7
Barwienie białek w żelu ...........................................................................................................7
Western blot . ....................................................................................................................................8
Detekcja ....................................................................................................................................9
2. Analiza mutantów RNAi w genach kodujących warianty histonu H1 ................10
RT-PCR............................................................................................................................................10
Matrycowy RNA ......................................................................................................................... 10
Odwrotna transkrypcja ................................................................................................................ 11
Półilościowy RT-PCR . ................................................................................................................ 11
Izolacja całkowitego RNA ............................................................................................................. 11
Synteza jednoniciowego cDNA . ....................................................................................................12
Półilościowy multiplex PCR...........................................................................................................13
Przygotowanie żelu agarozowego ............................................................................................... 13
3. Badanie oddziaływań białek - drożdżowy system dwuhybrydowy......................14
AtSWI3B .........................................................................................................................................14
FCA . ................................................................................................................................................14
Schemat doświadczenia..................................................................................................................15
Transformacja drożdży
(…)
…) –
syntezę cDNA przeprowadza się w optymalnych
warunkach przy użyciu odpowiedniego
primera (patrz pkt „odwrotna transkrypcja”).
Uzyskany cDNA służy następnie jako matryca
w „zwykłych” reakcjach PCR. Metoda ta
umożliwia analizę wielu transkryptów z jednego
cDNA. Ponadto dzięki optymalnym warunkom
odwrotnej transkrypcji i reakcji PCR, umożliwia
ona amplifikację długich produktów (nawet
kilkanaście tysięcy par zasad).
Matrycowy RNA
Jako matrycowy RNA może służyć zarówno
mRNA, jak i całkowity RNA komórkowy (ten wariant
zostanie użyty w ćwiczeniu). Aby osiągnąć dobrą
wydajność odwrotnej transkrypcji, wyizolowany
RNA musi być czysty - przede wszystkim nie
powinien być zanieczyszczony DNA. Ewentualną
obecność DNA w izolacji można sprawdzić w różny
sposób, m.in. ustawiając reakcję kontrolną bez
Analiza Mutantów…
… wprowadzanie cząsteczek
plazmidu do komórek drożdży. Drożdże po
transformacji wysiewa się na pożywkę minimalną
(WO) z dodatkiem jedynie tych aminokwasów,
których dane transformanty nie są w stanie same
syntetyzować. Na plazmidzie pGBT9 znajduje
się jeden z genów szlaku biosyntezy tryptofanu,
natomiast na plazmidzie pGAD424 oraz pLC1
– leucyny. Dlatego też drożdże po transformacji
plazmidem / konstruktem…
... zobacz całą notatkę
Komentarze użytkowników (0)