To tylko jedna z 2 stron tej notatki. Zaloguj się aby zobaczyć ten dokument.
Zobacz
całą notatkę
Izolacja DNA
Cel: Wysokocząsteczkowy preparat (20-50kpz)
Wysoki stopień czystości (DNA pozbawiony białek i inhibitorów enzymów)
Wysoka wydajność
Ogólne zasady izolacji zbliżone dla DNA pozyskiwanych z różnych komórek (bakterie, rośliny, zwierzęta)
I etap: Mechaniczna maceracja tkanki lub liza komórek
II etap: Wysolenie białek z lizatu, odbiałczenie preparatu poprzez ekstrakcję fenolem i chloroformem
III etap: Usunięcie zanieczyszczeń chemicznych (precypitacja etanolem), rozpuszczenie osadu DNA w buforze (TE)/ wodzie.
Wybór metody zależy od dalszego przeznaczenia preparatu.
Najwyższą czystość uzyskuje się poprzez wirowanie w gradiencie gęstości CsCl lub czyszczenie na kolumnach chromatograficznych.
Ilościowa i jakościowa ocena preparatu DNA:
Spektrofotometryczny pomiar absorbancji (A) w UV A260=1 dla:
dsDNA o stęż 50µg/ml
ssDNA o stęż 33µg/ml
RNA o stęż 40µg/ml
Różnice w absorbancji to wynik złożoności struktury DNA i RNA.
Stężenie dsDNA oblicza sę wg wzoru:
C(µg/ml)= (A260/A320) x 50 x rozcieńczenie
Wartość A260/A280 świadczy o stopniu zanieczyszczenia białkami
A260/A300- zanieczyszczanie związkami chemicznymi.
Wartość 1,8-2- wysoka jakość preparatu.
Kształt i max wartości widma UV- informacja o stopniu i typie zanieczyszczeń DNA zw chem stosowanymi podczas izolacji (np. fenol). Każdy z nich wykazuje inne, charakterystyczne dla siebie cechy (zalecane wykonanie pomiaru A przy kilku dł fali, a przy ostatecznej ocenie jakości DNA uwzględnić tzw tło).
Aktywność biologiczna preparatów DNA:
Oceniana jest m.in. na podstawie podatności DNA na hydrolizę restryktazami.
Porównanie obrazu preparatów niestrawionych i trawionych (po elektroforezie) informuje o ich jakości.
Nietrawione DNA- brak efektów niespecyficznej degradacji.
Po wybarwieniu żelu kończącego elektroforezę widoczny pojedynczy „prążek” (homogenna frakcja fragmentów DNA tej samej długości 25-50kpz).
DNA trawione ednonukleazami- efekt odwrotny, tj populacja licznych fragmentów DNA różnych wielkości (genomowe DNA). Smuga powstała w wyniku rozdrobnienia, fragmenty nakładające się na siebie.
W przypadku plazmidowych DNA- kilka różnych form, każda migruje w żelach z inną prędkością. Różnica w obrazie plazmidów trawionych i nietrawionych restryktazami.
Plazmidy- preparat nietrawiony-
(…)
… w wyniku rozdrobnienia, fragmenty nakładające się na siebie.
W przypadku plazmidowych DNA- kilka różnych form, każda migruje w żelach z inną prędkością. Różnica w obrazie plazmidów trawionych i nietrawionych restryktazami.
Plazmidy- preparat nietrawiony- w postaci prążków, np. 3 paski: formy: liniowa, superskręcona itd.
Plazmidy- preparat trawiony- 1 pasek (jedna forma liniowa, przecięcie w 1 mscu…
... zobacz całą notatkę
Komentarze użytkowników (0)