Metody szacowania stężeń DNA za pomocą płytek agarozowych - wykład

Nasza ocena:

5
Pobrań: 49
Wyświetleń: 2198
Komentarze: 0
Notatek.pl

Pobierz ten dokument za darmo

Podgląd dokumentu
Metody szacowania stężeń DNA za pomocą płytek agarozowych - wykład - strona 1

Fragment notatki:

Metody szacowania stężeń DNA za pomocą płytek agarozowych, jakie są jej wady i zalety. Czy istnieje alternatywa tej metody? Metoda jest przydatna tylko do szacowania niskich stężeń DNA np.. w przypadku izolacji z żelu agarozowego. Do określenia ilości DNA w badanej próbce oraz stopnia jego czystości stosuje się metody spektrofotometryczne. Opis metody: 1. Na szalki Petreigo wylać podgrzany roztwór agarozy w buforze TE, zawierający bromek etydyny (st. końcowe 1ug/ml) 2.Przygotować standardy DNA (zakres standardów powinien obejmować stężenia DNA od 5-100ng/m), DNA faga lambda w roztworach o znanym stężeniu. 3.Zaznaczyć punkty nanoszenia próbek badanych oraz standardów. 4.Nakładać po 0,5ul 5. Pozostawić płytki do wchłonięcia próbek przez agarozę.
6.Stężenia DNA w badanych próbka określa się na transiluminatorze (UV 254nm), porównując stopień fluorescencji względem standardów.
Alternatywą tej metody jest pomiar absorpcji światła UV. Do pomiaru spektrofotometrycznego preparaty muszą być z reguły rozcieńczone 100x H2O lub buforem TE. Do kalibracji spektrofotometru używa się tego samego roztworu co do rozcieńczeń preparatów. Po kalibracji odczytuje się wartość absorpcji punktowo przy 260, 280 i 320nm lub wykonuje się widmo w zakresie 200-350nm. Absorbancja przy 260nm jest równa 1 dla dwuniciowego DNA o stężeniu 50ug/ml, dla jednoniciowego DNA o stężeniu 33ug/ml i RNA o stężeniu 40ug/ml. Różnice w absorbancji są wynikiem złożoności struktury. Stężenie dwuniciowego DNA oblicza się wg wzoru: C(ug/ml)=(A260-A320) x 50 x rozcieńczenie
Stężenie jednoniciowego DNA oblicza się: C(ug/ml)=(A260-A320) x 33 x rozcieńczenie
Na ustalenie stężenia DNA maja wpływ tez inne substancje dlatego zaleca się wykonanie pomiaru przy kilku długościach fali. ( 230nm-EDTA, etanol, polisacharydy; 260nm- DNA, RNA; 270- etanol; 280nm-białka; 320nm-drobiny komo\órkowe). Stosunek wartości 260/280 świadczy o zanieczyszczeniu preparatów kw. Nukleinowych białkami. Wartość współczynnika między 1,8-2,0 oznacza, że preparaty są wystarczająco oczyszczone.
W odróżnieniu od pomiarów światła UV poprzez frakcjonowanie preparatów kwasów nukleinowych w żelu agarozowym można określić również ich jakość.
... zobacz całą notatkę

Komentarze użytkowników (0)

Zaloguj się, aby dodać komentarz