Na czym polega różnica w sekwencjonowaniu metodą Sangera i PCR sekwencyjnym? Metoda sekwencjonowania długich cząsteczek DNA polega na wytworzeniu zbioru cząsteczek różnej długości, z jednym typowym końcem. Cząsteczki te następnie są rozdzielane elektroforetycznie w żelu poliakrylamidowymy (PAGE) co pozwala odczytać sekwencje badanego DNA.
Sekwencjonowanie metodą Sangera (dideoksy) polega na enzymatycznej replikacji jednoniciowego lub uprzednio zdenaturowanego fragmentu lub klonu DNA w obecności trifosforanów 2'3'-dideoksyrybonukeozydów. Synteza rozpoczyna się od startera (przyłącza się do jednoniciowej matrycy i polimeraza DNA wykorzystując dNTP wydłuża starter), hybrydyzującego z matrycą w określonym, pojedynczym miejscu, a kończy wbudowaniem dideoksyrybonukleotydu do nowo powstałego łańcucha DNA. Badaną próbkę dzieli się na cztery porcje, oznaczone: A, C, G i T. Każda z nich zawiera tę samą matrycę, starter, mieszaninę czterech trifosforanów deoksyrybonukleozydów, odpowiedni bufor, polimerazę DNA oraz jeden z ddNTP, odpowiednio: ddATP, ddCTP, ddGTP lub ddTTP. Stężenie ddNTP musi być tak dobrane, by zapewniało inkorporację średnio jednego ddNTP w trakcie syntezy jednego łańcucha DNA, o długości 200, 400 czy 800 nt. Zdenaturowane produkty syntezy- oddzielone od matrycy i pozbawione struktur II rzędowych rozdziela się elektroforetycznie w czterech oddzielnych ścieżkach 6-8% żelu poliakryamidowego zawierającego 7M mocznik, w temperaturze 55-70'C.
Dideoksynukleotydy działają jako terminatory wydłużania łańcucha ponieważ nie zawierają grupy 3' -OH ( obecność tej grupy jest niezbędna aby polimeraza mogła wydłużyć rosnący łańcuch). Znacznik można wprowadzić na etapie syntezy ( stosując jako jeden z substratów np. [alfa-35S]dATP) lub można użyć już znakowany starter. Starter znakuje się albo za pomocą związków radioaktywnych albo barwników fuorescencyjnych.
Badana matryca powinna być pojedynczym klonem, homogennym produktem PCR, a w przypadku bezpośredniego sekwencjonowania genomowego DNA, powinna pochodzić z jednego organizmu. DNA powinien być odbiałczony ( zazwyczaj plazmidowy DNA przygotowany standardowa metodą lizy alklicznej może być z powodzeniem sekwencjonowany, lecz doczyszczenie niektórych preparatów daje dobre efekty). Innym, istotny czynnikiem decydującym o dobrej jakość wyników jest maksymalna wybiorczość i wydajność hybrydyzacji stosowanego startera z badanym DNA. Optymalny, molowy stosunek startera do jednoniciowej matrycy wynosi 1:1 ( w przypadku matryc dwuniciowych stosuje się dwukrotny nadmiar startera).
Pytanie to nie jest dokonczone... :( na katedrze kazali czekać na wykład, jak tylko będzie to szybciutko dokończę :) W razie jakiś problemów proszę pisać :)
(…)
… na enzymatycznej replikacji jednoniciowego lub uprzednio zdenaturowanego fragmentu lub klonu DNA w obecności trifosforanów 2'3'-dideoksyrybonukeozydów. Synteza rozpoczyna się od startera (przyłącza się do jednoniciowej matrycy i polimeraza DNA wykorzystując dNTP wydłuża starter), hybrydyzującego z matrycą w określonym, pojedynczym miejscu, a kończy wbudowaniem dideoksyrybonukleotydu do nowo powstałego łańcucha…
... zobacz całą notatkę
Komentarze użytkowników (0)