Wykład 6
23.03
Analiza produktów PCR
Co należy zrobić, aby produkty były specyficzne?
• Wpływ ma długość starterów → temperatura hybrydyzacji → temperatura syntezy. Przy odpowiednim
doborze wszystkich tych aspektów otrzymujemy specyficzny produkt.
Co po PCR?
• elektroforeza (najłatwiejsza metoda analizy produktu PCR)
• RFPL - trawienie enzymem restrykcyjnym – najczęściej do sprawdzenia zachodzącej mutacji
• klonowanie
W reakcji PCR wykorzystywana jest polimeraza
Tag, a zatem otrzymujemy produkty o końcach tępych.
Polimeraza Tag posiada szczątkową aktywność terminalnej transferazy.
Aby otrzymać lepkie końce dodajemy reszty A na
końcach cząsteczki, a w wektorze komplementarne
reszty T.
Jak można zrobić to ‘samemu‘?
Należy wektor przygotować poprzez przecięcie enzymem dającym końce tępe. Następnie użyć polimerazy Tag i tylko jednego nukleotydu, wtedy uzyskujemy
wektor gotowy do klonowania. {...}
Produkty PCR można też klonować w sposób bardziej specyficzny – przy zachowaniu ramki odczytu.
Korzystamy wówczas z miejsc restrykcyjnych – różne
możliwości:
• Wykorzystujemy istnieące miejsce restrykcyjne w produkcie PCR. Patrzymy wówczas, czy takie
miejsce istnieje w wektorze, jest komplementarne, jest
zachowana ramka odczytu. Wybieramy takie startery,
by cząsteczka DNA zawierała miejsca restrykcyjne, po
PCR trawimy i produkt posiada lepkie końce i może
być klonowany.
• Sekwencja restrykcyjna nie występuje w sekwencji amplifikowanej. W tym przypadku starter jest tak
zaprojektowany, iż miejsce restrykcyjne jest zawarte
w sekwencji startera, ale nie występuje w matrycy. W
pierwszej hybrydyzacji ta sekwencja nie paruje z matrycą, ale w kolejnych cyklach otrzymujemy produkty
już z danym miejscem restrykcyjnym.
Lepiej gdy za miejscem restrykcyjnym występuje co
najmniej kilka reszt, wtedy jest wydajniejsze trawienie
(niektóre enzymy nie trawią, gdy miejsce restrykcyjne
jest na początku).
Polimeraza Tag
• enzym termostabilny
• aktywność polimerazowa
• szczątkowa aktywność terminalnej transferazy
• nie posiada aktywności nukleazowej
• brak aktywności korekcyjnej – zatem polimeraza
się myli i trzeba być tego świadomym (1 błąd na 10000)
Za mutację jest odpowiedzialny zły dobór substratów, czyli dNTPów (czasem celowo dodaje się nadmiar
jednego dNTP, aby wprowadzić przypadkowe mutacje).
Zatem przy ustalaniu sekwencji należy przebadać
kilka różnych klonów z biblioteki produktów, aby wykluczyć cząsteczki posiadające mutacje powstałe przez
polimerazę Tag. Z reguły do sekwencjonowania używamy polimerazy z aktywnością poreakcyjną. Polimeraza Tag jest łatwa i wygodna w użyciu, zatem najczęsciej używamy jej, gdy nie zależy nam na dokładnej
znajomości sekwencji.
Real-time PCR
(ilościowy PCR w czasie rzeczywistym)
• Ilość produktu na końcu reakcji zależy od ilości
substratuna początku reakcji – prosta zależność leżąca
u podstaw RT-PCR
• Im więcej substratu na początku, tym szybciej
zauważymy produkt metody: określenie ilości DNA w
próbce.
Po co? Żeby określać różne problemy ilościowe.
Cóż za błyskawiczna odpowiedź!
Podstawa techniki – pomiar produktu w czasie, różne sposoby:
• W mieszaninie reakcyjnej obecna substancja
która fluoryzuje po związaniu z cząsteczką dsDNA.
Urządzenie mierzy stężenie fluorescencji. Wadą jest,
że może parować również do startorów dając błędny
obraz.
• Amplifikowane DNA jest przyłączane do skonstruowanej, komplementarnej sondy.
Sonda
oligonukleotydowa
DNA docelowe
DNA
Sonda
Na końcach sondy znajdują się cząsteczki, które posiadają następujące właściwości: jedna z nich fluoryzuje, druga natomiast znosi fluorescencję pierwszej.
Sonda – oligonukleotyd, który po obniżeniu temperatury hybrydyzuje z produktem i fluoryzuje.
P
W (1) było najwięcej DNA, ponieważ potrzeba było
mniej cykli, aby osiągnąć wymaną ilość produktu. W 2
i 3 wymagana była większa ilość cykli.
Sygnał jest mierzony dla konkretnej wartości, który
jest dostatecznie pewny, tzw. próg pomiaru.
Po ustaleniu progu pomiaru mierzy się, po jakiej
liczbie cykli próbka przekroczy próg pomiaru.
RT-PCR może też słżyć do analizy ilości transkryptu (nie tylko DNA), wygląda jak standardowy PCR, ale
najpierw musimy uzyskać matrycę. Potrzebujemy odwrotnej transkryptazy.
RNA
Odwrotna transkryptaza
RNA
Degradacja nici RNA
Standardowe PCR
Do czego jest nam to potrzebne?
• do wykrywania wirusów patogennych z RNA
• do analizy ekspresji genu
Sekwencjonowanie genów i genomów
Początki sekwencjonowania sięgają lat 70’ ubiegłego wieku.
Metoda Sangera – używana do sekwencjonowania
małych genomów. Metoda ta wykorzystuje techniki
elektroforezy wykonywanej w szczególnych warunkach – odróżniane są produkty różniące się jednym nukleotydem. W tej metodzie stosowany jest wysokorozdzielczy żel poliakryloamidowy i cząsteczki DNA są
całkowicie zdenaturowane. Denaturacje uzyskuje się
dzięki mocznikowi oraz temperaturze.
Opis metody: Dysponujemy (jednoniciowym)
DNA. Jednoniciowy, bo wykorzystujemy reakcję polimerazową. Do reakcji wykorzystujemy dNTP, matrycę, startery, polimerazę oraz dideoksynukleotydy
(związek ten w pozycji 3 nie posiada grupy OH, tylko
H, grupa OH potrzebna jest do wydłużania łańcucha).
Należy pamiętać, że dNTP → ddNTP (dideoksynukleotydów). Otrzymujemy kolekcję DNA o różnych długościach. W zależności od tego, w których miejscach
został przyłączony ddNTP. Dodatkowy każdy ddNTP
jest znakowany różnym kolorem fluorescencyjnym.
Przy pomocy elektroforezy i detektora. Otrzymujemy
informacje na temat długości {...}
Polimerazy używane do sekwencjonowania:
• polimeraza DNA1 – (na początku) posiada aktywność nukleazową, co prowadziło do hydrolizy produktów.
• fragment Klenowa – pozbawiony aktywności
nukleazowej 5’→3’. Problemem jest to, że jest mało
procesywny (jest dłgo związany z matrycą).
• sekwenaza – pochodna polimerazy z faga T7. Nie
posiada aktywności egzonukleazowej 5’→3’, wysoko
procesywna (ponad 700 pz), akceptuje pochodne nukleotydów.
Skąd pojedyncza nić? Na przykład z faga M13, ale
fragmenty nie są długie; użycie fagemidów; denaturacja DNA.
Sekwencjonowanie termiczne
Po pierwsze cząsteczka DNA jest denaturowana
przez temperaturę. Następnie, w konkretnej temperaturze jedna z nici hybrydyzuje ze starterem. Produkt
jest syntezowany przez polimerazę termostabilną. Jest
obecny tylko jeden starter. Nie ma amplifikacji sekwencji tylko w kolejnych cyklach produkt jest syntezowany. Mówimy o tak zwanym PCR asymetrycznym.
Podobnie jak w metodzie Sangera, w sekwencjonowaniu termicznym znajdują się dNTP oraz ddNTP. W
metodzie tej zachodząmutacje, ale nie mają one większego znaczenia, gdyż nie są powielane, a mutacje,
które nawet powstały są ‘tłumione’ przez cząsteczki
niezmutowane.
Startery używane do sekwencjonowania
• Starter musi być komplementarny do sekwencjonowanej cząsteczki.
• Starter uniwersalny jest komplementarny do
wektora i sekwencjonuje DNA insertu (dowolnego).
Wygodna metoda, bo nie znamy DNA insertu, a zatem
trudno byłoby znaleźć odpowiedni starter. Jedynym
warunkiem jest odpowiednia długość startera.
• Startery wewnętrzne są używane, gdy dłgość insertu jest zbyt długa. Najpierw używamy startera uniwersalnego, by zbadać część sekwencji, a po jej poznaniu zaczynamy używać ognia, bo trzeba się wykazać
niezwykłym wyczuciem w ich projektowaniu. Lepiej
używać uniwersalnych.
... zobacz całą notatkę
Komentarze użytkowników (0)