To tylko jedna z 3 stron tej notatki. Zaloguj się aby zobaczyć ten dokument.
Zobacz
całą notatkę
Techniki sekwencjonowania DNA Metoda chemiczna- Gilberta & Maxama- określanie kolejności nukleotydów dowolnego odcinka DNA (Nobel 1980)
Metoda Sangera:
Enzymatyczna- terminacji łańcucha, dideoksy. Szybka, prostsza.
Istota: ddNTP włączane do nowo syntetyzowanego łań DNA przez pol DNA blokowały włączenia kolejnych nukleotydów.
Naturalny mechanizm replikacji tj synteza łańcucha DNA, od startera, do wbudowania jednego z 4 dideoksynukleotydów.
Produktu reakcji rozdzielane w żelach, wynik w postaci autoradiograficznej lub fluorogramu (wysokonapięciowa elektroforeza w warunkach denaturacji PAA + mocznik). Stosowana przy sekwencjonowaniu dłuższych fragmentów DNA.
Szereg modyfikacji podnoszących efektywność (m.in. zastosowanie sekwenazy).
Odkrycie taq polimerazy- połączenia PCR-sekwencjonowanie.
Na tej podstawie opracowano tzw sekwencjonowanie cykliczne, nie wymagało konieczności uprzedniego, czasochłonnego klonowania fragmentu DNA przeznaczonego do analizy (przyspieszenie procedury).
Metoda wykorzystywała radioaktywne znaczniki pozwalające uwidocznić wzór prążków na autoradiogramie po rozdziale elektroforetycznym.
Rozdział wyznakowanych fragmentów DNA powstałych w reakcji sekwencjonowania:
Końce każdego z fragmentów są znakowane fluorescencyjnym markerem (odpowiedni dla każdej z 4 zasad dideoksynukleotydów), powoduje przerwanie syntezy łańcucha. Barwa jaką emituje znacznik w świetle lasera, pozwalał zidentyfikować tę zasadę.
Laser skanuje powierzchnię żelu, w którym dokonywany był rozdział, a elektroniczny czujnik rejestruje barwę fali emitowanej przez dany pasek DNA na żelu.
Informacje te przekazywane są do komputera, Turaj rejestrowane, systematyzowane i analizowane (odpowiednie oprogramowanie).
Nowsze techniki sekwencyjne:
Automatyzacja procesu, wprowadzenie znaczników fluorescencyjnych. Odczyt bezpośrednio w trakcie przesuwania się prążków przed detektorem, wydrukowany lub zapisany w komputerze.
Mimo postępu, ciągle minusem pozostaje odczyt stosunkowo krótkiej sekwencji z jednego eksperymentu. W sekwenatorach nowszej generacji elektroforezy w żelu zastąpiono kapilarami.
„Skok” dzięki pirosekwencjonowaniu, nie wymaga rozdziału i umożliwia bezpośrednie śledzenie włączania kolejnych nukleotydów do nowo tworzonej nici DNA
Kolejny postęp technologiczny- mikroczipy/ mikromacierze, proces oparty na hybrydyzacji sekwencjonowanej cząsteczki do układu oligonukleotydów i elektronicznej detekcji jej wyników
Każda z metod ma zalety i wady
Sekwencjonowanie dużych genomów wykonuje się w wysoce wyspecjalizowanych laboratoriach
(…)
… z metod ma zalety i wady
Sekwencjonowanie dużych genomów wykonuje się w wysoce wyspecjalizowanych laboratoriach
Enzymy technik sekwencyjnych:
Pierwotnie polimeraza DNA I z E.coli, następnie fragment Klenova polimerazy, obecnie polimeraza Taq z Thermus Aquaticus oraz polimeraza faga T7 (sekwenaza) z E.coli (możliwość syntezy i odczytu długich sekwencji (>600nt). Posiadają zdolność wydłużania startera…
… nastąpi terminacja reakcji
Żaden naturalny enzym nie spełnia wszystkich tych kryteriów, dlatego stosuje się sztucznie modyfikowane białka (np. fragment Klenov- polimeraza DNA I pozbawiona aktywności 5'-3; przez odcięcie pewnej części białka (ale ma ona wtedy dosyć niską procesywność). Najbliższa ideału jest sekwenaza (nazwa handlowa)
Projekt sekwencjonowania genomu ludzkiego (HGP- Human Genome Project…
…- ORF, czy typowych kodonow translacji, utrudnia poszukiwanie tradycyjnymi metodami)
Ujawnienie nieznanych wcześniej faktów (multiplikacja całych genomów, duplikacje genów, struktura genów). Niektóre z kopii genów mutują w kierunku nowych, korzystnych cech (ewolucja sekwencji)
Możliwość precyzyjnych manipulacji w kierunku ich modyfikacji (biotechnologia, medycyna molekularna, terapia genowa)
Rozwój…
... zobacz całą notatkę
Komentarze użytkowników (0)