SEKWENCJONOWANIE
Sekwencjonowanie DNA:
1980: nagroda Nobla dla Sangera, Gilberta za opracowanie metod sekwencjonowania DNA
1988: powstanie projektu sekwencjonowania genomu ludzkiego (HGP)
1995: pierwszy, całkowicie poznany genom- Haeomophilus influenzae
1997: pierwszy genom eukariotyczny S.cerevisiae
2000: Drosophila melanogaster, Arabidopsis thaliana
2004: ogłoszono rozszyfrowanie genomu człowieka (Venter, Collins)
Początek- org o najmniejszych genomach (niedoskonałość technik i narzędzi badawczych).
Do roku 2000 poznano w pełni genomy jedynie 22 Eukaryota
Po roku 200 blisko 1700 (dane z 7.05.2011)
Aktualnie realizowanych 8000 projektów sekwencjonowania genów, w tym 2000 eukariotycznych: kukurydza, ziemniak, pomidor, fasola, tytoń, żyto, soja, kawa, kapusta, burak, cebula, sorgo.
Od połowy lat 90 wykładniczy wzrost liczby kompletnie zsekwencjonowanych genomów- intensywny rozwój genomiki.
Sekwencjonowanie genomów:
Techniki opracowywano na genomach bakteriofagowych.
Jednym z najmniejszych, zsekwencjonowanych jako pierwszy- genom faga φX174 (Sanger).
Analiza sekwencji po raz pierwszy ujawniła obecność genów zachodzących.
Wiedza wynikająca z poznania I-rzędowej struktury genomów innych fagów pozwalała m.in. na analizy porównawcze i ujawnienie nowych, specyficznych genów dla poszczególnych fagów.
Spośród mikroorganizmów pierwsze prace sekwencyjne (mapowania innymi technikami prowadzono wcześniej) były E.coli i Helicobacter pylori (pełne sekwencje 1997).
Analiza genomów Eukaryota ujawniła m.in. nieciągłą strukturę genów (egzony, introny), charakterystyczne elementy jednostek transkrypcyjnych itd.
Kryteria wyboru obiektu badań:
Rozmiary genomu (zaczynano od poznania najmniejszyh genomów: fagi, organella komórkowe, bakterie, najprostsze wielokomórkowce)
Aktualny stan zaawansowania metod molekularnych i informatycznych- bioinformatyka (najbardziej dynamiczny rozwój od lat 90)
Organizmy modelowe (E.coli, A.thaliana, C.elegans), dotychczasowa wiedza na ich temat (np. kom drożdży ciągle pozostają ważnym modelem w badaniach kom ludzkich i innych Eukaryota- w tym np. mech regulacji funckjonowani genów, interakcji między nimi)
zapotrzebowanie ze strony firm biotechnologicznych (rolnictwo), medycyna, przemysł spożywczy, farmaceutyczny
Uwarunkowania w sekwencjonowaniu DNA na dużą skalę:
Systematyczne doskonalenie metodyki/technologii (w tym m.in. automatyzacja procesu)
Rozwój komputeryzacji (pojemność dysków, szybkość procesó, Internet- wymiana danych), postęp oprogramowania, metod obliczeniowych, algorytmów. Wszystko to ma znaczenie w: składaniu zsekwencjonowanych fragmentów, gromadzeniu danych, analizie danych (identyfikacja sek kodujących, porównywaniu genomów). Wydajność komputerów podwaja się co ok. 1,5 roku (podobnie pojemność baz danych)
(…)
…'- polimeraza DNA Klenov).
Taki fragment jest preferencyjnie zrywany w miejscach występowania jednej z czterech zasad.
Etap poprzedzony chemiczną modyfikacją każdego z 4 nukleotydów (pula fragmentów DNA dzielona na 4 porcje, każda poddawana innym reakcjom chemicznym).
Specyficzne zrywanie łańcucha przy pomocy odczynników, które modyfikują, a później odrywają zasadę od cukru w danym nukleotydzie.
Puryny usuwane działaniem DMS (siarczan dimetylu), następnie ogrzewanie DNA w środowisku alkalicznym różnicuje dodatkowo A i G.
Pirymidyny odszczepiane od deoksyrybozy przy udziale hydrazyny, następnie w obecności piperydyny i NaCl różnicuje się oderwanie C i T.
Końcowe rezultaty- z odczyt autoradiogramu, po elektroforetycznym rozdziale produktów degradacji.
Wada: metoda czaso i pracochłonna, wymaga sporego doświadczenia
Zaleta: potrafi jednoznacznie identyfikować złożone układy sekwencyjne jakimi są np. sługie szyki krótkich sekwencji powtórzonych. Wykorzystywana szczególnie przy oznaczaniu sekwencji niedużych odcinków DNA- do kilkuset zasad.
…
... zobacz całą notatkę
Komentarze użytkowników (0)