Narzędzia inżynierii genetycznej- enzymy
Enzymy restrykcyjne (restryktazy)- endonukleazy bakteryjne. Hydroliza DNA przy ich użyciu to pkt wyjścia do innych technik IG. Powstałe frakcje DNA to substraty dla dalszych analiz, mają identyczne zakończenia (nie są losowe). Rozpoznają tzw sekwencje palindromowe w większości odmienne. Wyjątki: izoschizomery.
Nazewnictwo: Pierwsza litera- rodzaj bakterii
Druga i trzecia- gatunek
Następna- szczep lub typ
Kolejne enzymy z danego szczepu lub typu otrzymują cyfry rzymskie (np. EcoRI, EcoRII, EcoRV)
Jednostka enzymu- to jego ilość, która kompletnie hydrolizuje 1µg DNA faga λ (około 50kb) w czasie 1h w temp 37ºC. Istotne proporcje DNA: enzym w ustalaniu parametrów reakcji enzymatycznej (star activity)!!! Np. nadmiar enzymu może powodować, że pojawiają się dodatkowe aktywności oprócz tych, które są przypisane danemu enzymowi. Poza fragmentami określonymi, mogą się pojawiać jakieś dodatkowe.
Izoschizomery:
Istnieją enzymy takie, które je posiadają i takie, które nie posiadają.
Izolowane z różnych organizmów, rozpoznają takie same motywy sekwencyjne (np. niektóre pary izoschizomerów różnią się wrażliwością na metylację C, A np. HpaII-Msp czy MboI-Sau3A)
Niekiedy enzymy generują identyczne wystające końce (kompatybilne), mimo rozpoznawania różnych sekwencji DNA (np. BamHI- G/GATCC i MboI- /GATC)
Restryktazy rozpoznające bardziej złożone motywy (8 nukleotydów) np. AsiSI, AscI, SwaI, SbfI wykorzystywane w analizach całkowitych, genomowych DNA, gł pozyskiwanych z org Eucaryota
Ważne jest, aby wiedzieć czy dany enzym generuje tępe, czy lepkie końce:
Tępe końce (płaskie)- 2 nici cięte w sposób symetryczny
Wystające końce (lepkie)- brak symetrii cięcia w komplementarnych niciach
Nie zawsze sekwencja rozpoznawana przez enzym jest precyzyjnie określona co do 1 nukleotydu
Enzymy rzadko tnące- generują mniej fragmentów
Rozpoznawane 4 nukleotydy- smuga spowodowana nakładaniem się na siebie dużej ilości fragmentów
6 nukleotydów- wyżej
8 nukleotydów- jeszcze wyżej
Enzymy restrykcyjne stwarzają możliwość konstrukcji map fizycznych DNA (hydroliza wieloma enzymami), na podstawie analizy rozdziału elektroforetycznego produktów reakcji hydrolizy.
Użyteczne w diagnostyce molekularnej m.in. dzięki nim wykrywane są mutacje odpowiedzialne za występowanie chorób (Southern, RFLP).
EcoRI- charakterystyka enzymu:
(…)
…- zmodyfikowana Tag polimeraza generuje produkty PCR z tzw ogonami dAa na 3' końcach (stwarza możliwość klonowania ich w liniowanym wektorze kloningowym zawierającym oligo-dT na 5' końcu (np. wektor pGEM)
Mezofilne polimerazy DNA:
Izolowane z drobn zdolnych do wzrostu w temp umiarkowanych.
Optymalna temp wzrostu zależna od gatunku 20-37
Grupa enzymów, w tym: DNA polymerase I E.coli; Klenov fragment, T4 DNA…
… (lepkich) i ich łączenie (na przykładzie BamHI, BglII, BclI, Sau3A). DNA z jednego lub innych źródeł.
Ligaza DNA
3) Formowanie tępych (płaskich) końców przez wypełnianie lepkich końców powstałych po hydrolizie enzymami, które nie tworzą końców wobec siebie komplementarnych (np. HindIII, EcoRI, BamHI).
Polimeraza DNA, dNTP, ligaza DNA + ATP (po inaktywacji restryktaz)
4) Tworzenie i łączenie płaskich…
… sonikacji (czas, natężenie impulsu, liczba impulsów).
Podstawowe enzymy w technikach IG- modyfikujące DNA/RNA:
1) Odwrotna transkryptaza- polimerazy DNA zależne od RNA.
Synteza nici DNA komplementarnej do matrycy RNA w kierunku 5'-3', wymagają startera z wolną gr 3'-OH i dNTP, zależnie od rodzaju, opt działania w 37-50ºC
2) Terminalna transferaza- dodaje kilka nukleotydów do końca 3' DNA/RNA
3) DNA polimeraza Taq- izolowana z bakterii termofilnych (Thermus aquaticus). Opt działania 72ºC (stabilna w 94ºC), technika PCR
4) Polimeraza DNA I- synteza nici DNA komplementarna do matrycy DNA (m.in. fragment Klenow pozbawiony aktywności egzonukleazy 5'-3'
5) RNaza A- nukleaza, degraduje RNA nie naruszając DNA
6) RNaza H- nukleaza, trawi nici RNA w strukturach hybrydowych RNA-DNA
7) Polimerazy RNA- np. T3, T7…
… sond molekularnych
11) Exonukleaza lambda- 5'-3' egzodeoksyrybonukleaza, selektywnie trawi 5' fosforyzowany łańcuch dwuniciowego DNA
Niemal wszystkie enzymy stosowane w IG występują w licznych wersjach, każda maswoiste cechy i wynikający z nich zakres zastosowań (ang. Features, applications)- opis producenta.
Termofilne polimerazy DNA:
Bogata oferta enzymów tej grupy (liczne białka rekombinowane…
…- plazmid z wstawką DNA (brak ekspresji genu β-galaktozydazy.
W komórkach bakterii pojawia się w ok. 200 kopiach (zależnie od temp hodowli)
Defosforylacja końców- uniemożliwia zamkniecie niezrekombinowanego plazmidu.
Selekcja bakterii po transformacji pBR/ pUC:
pBR322- bakterie z plazmidami rekombinowanymi (z wstawką obcego DNA) rosną na podłożu agarowym z dodatkiem Amp, a nie rosną na Tet, lub odwrotnie…
… innego organizmu.
Otrzymywanie: kolista cząsteczka, do niej wstawiane geny, sekwencje telomerowe, centromerowe, msce inicjacji replikacji
Drożdże jako gospodarz obcych genów:
Zalety:
Struktury komórkowe jak u Eukariota
Klonowane geny mogą zawierać introny
Obróbka mRNA zblizona do tej u wyższych Eucariota
Białka podlegają modyfikacjom posttranslacyjnym
Używane gdy chodzi o uzyskanie ekspresji genu…
… regulują poziom ekspresji genu zależnie od typu, stanu metabolicznego komórki i bodźców zew.
Wzmacniacz (enhancer)- aktywuje transkrypcję, często w znacznej odległości od sekwencji kodujących, niezależnie od orientacji i położenia. S
pecyficzność wobec typu komórki, odpwiedzi na bodźce. Geny o złożonej regulacji mają liczne wektory, każdy odp za ekspresję w danym typie komórki lub sytuacji. Może działać…
… z wklonowanym genem bakteriofaga T4 czy TT- z genem TT z grasicy cielęcej i wstawionym w genom E.coli.
Wektory:
Niewielkie, pozachromosomowe cząsteczki DNA/RNA (naturalne, sztuczne), nośnik interesującego fragmentu kwasu nukleinowego (bezpieczny transfer).
Stosowane do:
Klonowania (powielania)
Sekwencjonowania
Kolekcjonowania DNA (banki genowe, genomowe)
Ekspresja pożądanych genów
Rodzaje:
Plazmidy
Bakteriofagi
Kosmity
Sztuczne chromosomy
Wirusy
Dobór odpowiedniego zależy od przeznaczenia:
Wyboru komórek w jakich klonowane są geny (Pro, Eukaryota)
Sposobu wykorzystania fragmentów DNA (klonujące, ekspresyjne)
Wielkości klonowanych fragmentów (plazmidy, fagi, sztuczne chromosomy)
Brak wektorów uniwersalnych
Podstawowe cechy wektorów:
1) Zdolność do autonomicznej replikacji w danym typie komórek (obecność…
…), reguluje syntezę białek w oparciu o swoją sek i strukturę.
Komplementarnie do sek na końcu 3' 16S rRNA podj 30S. U Procaryota utożsamiane z sek Sine-Delgarno, zapewnia prawidłowy start tranlsacji (efektywne wiązanie rybosomy do mRNA). Sek wspomagające rozpoznawanie ATG przez rysosom.
Sch-D 5'-AGGAGGACAGCUAUG-3'
RBS spacer KI
KI- kodon inicjujący, wiązanie fMet-tRNA
U Eucaryota jej odpowiednik to sek
Kozak…
... zobacz całą notatkę
Komentarze użytkowników (0)