To tylko jedna z 3 stron tej notatki. Zaloguj się aby zobaczyć ten dokument.
Zobacz
całą notatkę
Lecytyny i cholesterol z żółtka jaja kurzego - izolacja i wykrywanie.
Etapy procesu izolacji:
Oddzieliłam żółtko od białka, a następnie zalałam żółtko mieszaniną etanol-eter dietylowy. Etanol spowodował denaturację pozostałości białka, natomiast w eterze rozpuściły się lipidy.
Odsączyłam zawiesinę na sączku karbowanym do kolby kulistej, po to aby pozbyć się zdenaturowanego białka i aby oczyścić roztwór lecytyn, kefalin i cholesterolu. Odparowałam eter dietylowy - część zatężonego roztworu zachowałam do analizy chromatograficznej (2).
Wkropliłam zatężony roztwór do zlewki z acetonem w celu wydobycia lecytyn i kefalin. Następnie osad lecytyn i kefalin odsączyłam na sączku karbowanym i część osadu zachowałam do analizy na płytce TLC (X); zachowałam także część przesączu do analizy TLC.
Pozostałą część osadu rozpuszczam w etanolu, po czym dodaję etanolowego roztworu chlorku kadmu, aby oddzielić kefaliny i lecytyny - lecytyna tworzy krystaliczny kompleks z CdCl2(3).
Odsączyłam kompleks lecytyn na sączku karbowanym do kolby kulistej, a następnie odparowałam rozpuszczalnik i pobrałam część osadu kompleksu lecytyny z CdCl2 do analizy chromatograficznej.
Chromatografia cienkowarstwowa TLC:
Następujące próbki nanoszę na szklane płytki pokryte żelem krzemionkowym:
W - wzorzec cholesterolu w chloroformie;
2 - wydzielone lecytyny, kefaliny i cholesterol;
X - surowy osad lecytyn i kefalin;
3 - kompleks lecytyn z CdCl2;
4 - pozostałość po wydzieleniu lecytyn.
Każdą z płytek rozwijam w dwóch układach:
- chloroform - MeOH - woda 65:25:4
- toluen - octan etylu 7:3
Następnie wywołuję płytki w następujący sposób:
spryskanie 0,1% roztworem ninhydryny w etanolu i wysuszeniu w piecu w 120 oC.
Spryskanie ninhydryną służy wykryciu wolnych grup aminowych.
umieszczenie płytki w komorze z jodem.
W ten sposób wykrywa się wiązania podwójne nienasyconych kwasów tłuszczowych. Plamki mają brunatny kolor na żółtym tle.
spryskanie 5% roztworem kwasu siarkowego i wysuszeniu w piecu w 120 oC.
Kwas siarkowy barwi cholesterol na kolor ciemnoczerwony.
Wyniki chromatografii:
CHCl3-MeOH-H2O
Toluen-CH3CO2Et
ninhydryna
- brak plamki dla wzorca cholesterolu (brak wolnej grupy -aminowej)
- pozostałe plamki 2, X, 3 oraz 4 ruszyły dość znacznie ze startu - układ jest dość polarny, więc powoduje migrację polarnych związków, którymi są lecytyny i kefaliny; wartości Rf:
Rf,2=2,8/6=0,47
(…)
…=0,5
oraz druga grupa plamek:
Rf,2=1/6=0,17
Rf,X=1,2/6=0,2
Rf,3=1,2/6=0,2
Rf,4=1/6=0,17
Wniosek: W próbkach 2,X,3 i 4 występuje wolna grupa aminowa. Jednak nie powinniśmy obserwować plamki w przypadku próbki nr 3 ponieważ powinna ona zawierać lecytynę, w której występuje cholina - czwartorzędowa sól amoniowa. Próbka musiała więc być zabrudzona kefalinami.
- plamki barwy fioletowej występują…
... zobacz całą notatkę
Komentarze użytkowników (0)