To tylko jedna z 6 stron tej notatki. Zaloguj się aby zobaczyć ten dokument.
Zobacz
całą notatkę
NOTATKA Z IZOLACJI RNA
Rodzaje RNA w komórce:
- rRNA- czyoi rybosomalne RNA- grupa kwasow nukleinowych wchodzacych w sklad rybosomu( ok.
80-85 % totalnego RNA)
- mRNA- to RNA informacyjne- koduje sekwencje aminokwasow w bialku, jest bezposrednią matrycą
jego syntezy ( ok.1-2% totalnego RNA)
- tRNA- transferowy- związany z enzymem - syntetazą aminoacylo-tRNA, służy do odczytywania
kodu genetycznego i transportu odpowiednich aminokwasów.
- snRNA i scRNA- male jadrowe i male cytoplazmatyczne RNA- niewielkie do ok 300 nukleotydów,
biorą udział w dojrzewaniu pre mRNA.
RNA
Kodujący ( 4% całości)
Niekodujący (96%
całości)
-pre- mRNA
- mRNA
-pre-rRNA
-pre-tRNA
-snRNA
-snoRNA
-scRNA
Tylko u eucariota: pre-mRNA, sn, sno, sc.
tRNA- krótka cząsteczka poniżej 100 nukleotydów,
rRNA- konkretnej długości
mRNA- w postaci smugi w żelu agarowym
Biologia molekularna
%1
Dlugie RNA dluzsze niz 200 nukleotydow, niekodujace, sa zaproponowane cztery rodzaje
mehcanizmow jako funkcjonuja: wabik- dlugie niekoujace rna umozliwia przhlaczenieclub odlaczeni
bialka od kwasu nukelinowego, scafold-rusztowani na kt ym buduja s. Ko pleky bialkoe ktore beda
penily okreslona funkcje, przenosnik- dlugie rna umozliia przylaczeni sie w bruzde kwasu
nukelinowego, kompleks bialkowy na bazie tego rna tworzy z kwasem nukelinoym petle i ekspresja
zostaje wzmocniona.
Zaczyna sie od rejonu promotorowego gdzie takie rna powstaje, ale tez moze w rejonach
miedzygeniwych i intronach ( transkrybowane z intronow wybranych genow),
Moe interferowac czyli zatrzymywac ekspresje, moze wplywac na remodeling chromatyny czy
histonow i regulowac ekspresje.
Najwiecej funkcji przypisuje sie :remodeling chromatyny- epigenetyczne procesy. Chromosom X,
jest inaktywowany Xist- inactivative specific transcriptor, umoziwia wygaszenie chrmosmu.
Moe hybrydyzowac z naszym transkryptem genu i blokowac spliceosom przez co regulowac
splicing i tworzyc alternatywne formy transkryptu albo naznaczac transkrypt do usuniecia.
Dlugie niekdujace rna po polaczeniu z bialkiem mozemodulowac aktywnosc
Moze tez posluzyc jako prekursor dla krotkich fragmentow rna.
Krotkie fragmenty rna ryzu znajdywane z watrobie :O dafaq. Dzialalo jako inhibitor LdLRap1 ktore
prawdopodobnie ma powinowactwo do ogonow cholesterolu ldl, usuwa ten cholesterol.
mRna matryca translacji: dna prsepisywane na mRna, ono przy udziale rybosomu ukega translacji i
powstaje lancuch polipeptydowy. I tworzy sie bialko.
2009 rok nobel dla ludzi za budowe rybosomu.
Inicjacja, elongacja, relaksacja i uwolnienie czasteczek.
Zaczyna sie od czynnika inicjujacego ,metionina.
Rybonukleazy:
Tam gdzie martwa tkanka tam tez sa RNAZY
Brak prostych metod inaktywacji. Hydrolizuja wiazania estrowe, degraduja kwas nukelinowy.
Posiadaj mostki disiarczkowe, co powoduje ich wieksza stabilnosc termiczną w wyniku ktorej nie
chca sie poddawac krotkiemu traktowaniu temperatura. Nie wymagaja jonow dwuwartosciowych.
Gdyby byly zalezne to
(…)
… komórkowe i białka enzymatyczne, przydaje sie przy izolacji z
komorek zwierzęcych.
2) Czynniki denaturujące : tiocyjanian guanidyny 3) Inhibitory RNaz: beta-merkaptoetanol lub DDT. Redukują one mostki disiarczkowe przez co
ułatwiają denaturację rybonukleaz,a co za tym idzie przyczyniają się do utraty przez enzym
aktywności nukleolitycznej.
4) Kompleksy wanadu -wiaza centra aktywne rnaz.
1.Izolacja fenolowa- efektywna ale odczynniki nas narazaja, np chlorek litu ktorym doczyszcza
sie.
2. Metoda chomczynskiego. Trizol: gotowy reagent, tiocyjanian guanidyny, fenol i chloroform.
Havzyk polega na tym ze ta tkanka ktora pan wykorzystal byla bogata w skrobie. Jezeli pojawia si
w tkance polifenole lub skrobia to moga sie pojawic klopoty i jakos izolacji jest gorsza.
3. Concert rna plant reagent: gotowy komercyjny…
…:
Izolacja całkowitego RNA z zastosowaniem TRIZOLU.
1. Homogenizować 50-100 mg tkanki w 1 ml roztworu
TRIZOL ( zawiera fenol i izotiocyjanian guanidyny) .
Homogenat inkubować 5 min w temp. 15-30 stopni.
2. Dodać 0,2 ml chloroformu, intensywnie mieszać i
inkubować 3 min w temp. 15-30 stopni
3. Fazy rozdzielic przez wirowanie. 12000rpm 15 mi. W
temp 2-8 stopni.
4. Zebrać fazę wodną, dodać 0,5 ml izopropanolu…
… bo jest szybka i tania oraz przydatna gdy mamy
wyizolowac RNA z malej ilosci komórek lub tkanek.
Po 3 punkcie otrzymujemy:
Ta metoda nadaje się również do izolacji
DNA ale musi spełniać inne warunki:
- fenol musi być bardziej zasadowy (pH
7-8)
- nie może być użyty izotiocyjanian
guanidyny
Izotiocyjanian guanidyny- silnie denaturuje białka i jest silnym inhibitorem rybonukleaz.
Izolacja RNA z wykorzystaniem złóż…
… krzemionkowych:
5) Liza komórek i inaktywacja endogennych RNaz- fenozol (mieszanina soli chaotropowych i
fenolu)
6) Dodajemy chloroformu, wirowanie - RNA pozostaje w fazie górnej, DNA i białka przechodzą do
fazy dolnej i interfazy ( jak na obrazku)
Biologia molekularna
%5
7) Zbieramy górną fazę ( dodajemy izopropanol) i nanosimy ją na mikrokolumnę ze złożem
krzemionkowym.
8) RNA osadza się na złożu…
... zobacz całą notatkę
Komentarze użytkowników (0)