Izolacja RNA - omówienie

Nasza ocena:

3
Pobrań: 126
Wyświetleń: 1568
Komentarze: 0
Notatek.pl

Pobierz ten dokument za darmo

Podgląd dokumentu
 Izolacja RNA - omówienie - strona 1  Izolacja RNA - omówienie - strona 2

Fragment notatki:

Izolacja RNA
RNA:
Mniejsze
Mniej stabilne
Bardziej zróżnicowane niż DNA
Główne typy: rRNA, mRNA, tRNA (rRNA 80%, mRNA 1-2%)
Większa różnorodność metod izolacji niż u DNA:
Izolacja konkretnego typu RNA poprzez frakcjonowanie totalnego
Bezpośrednia izolacja specyficznego RNA, ograniczona do komórek wyspecjalizowanych w nadprodukcji określonego białka
Izolacja poliA RNA
Izolacja RNA z polirybosomów
Główne zadanie:
Uproszczenie procedur
Zabezpieczenie RNA przed degradacją (szczególnie w analizach ekspresji mRNA, przygotowaniu biblioteki cDNA czy translacji in vitro- wysokocząsteczkowy materiał.
Główna frakcja całkowitego RNA to rRNA.
Różna klasy w obrębie gatunków:
Mysz, człowiek:
18S- 1,9kb
28S- 4,7kb
Drożdże: 18 i 26S- 3,8kb
Tytoń: 16, 18, 23, 25S
RNA znacznie bardziej narażony na degradację niż DNA
W materiale biologicznym i środowisku liczne, aktywne i stabilne RNazy
Zachowują one aktywność w 100ºC, w detergentach
Nie wymagają dla swojej aktywności kofaktorów (jony dwuwartościowe)
W izolacji RNA stosowane są silne związki degradujące białka: chlorowodorek guanidyny, izotiocianian guanidyny oraz inhibitory RNaz: DEPC (musi być następnie inaktywowany- autoklawowanie, brak inaktywacji hamuje aktywność enzymów do prac z RNA np. RT
Wstępny etap izolacji- usunięcie DNA (ekstrakcja kw, fenolem, DNaza)
RNA wolny od DNA można uzsykać wytrącając RNA w LiCl lub wirowaniem w gradiencie tiocianianu guanidyny
Chomczynski- autor cytowanych procedur izolacji RNA
Typy RNA- elektroforogramy, chromatogramy
Izolacja mRNA:
Frakcja heterogenna
Chromatografia powinowactwa z wykorzystaniem kolumienek wypełnionych złożem oligo dT, izolacja z całkowitego (totalnego) RNA.
Totalny RNA nanoszony na kolumnę chromatograficzną ze złożem oligo dT- obecność wystających ogonków oligo dT.
Kolumna ma zdolność wychwytywania mRNA, co jest związane z obecnością na końcu 3' ogonka poliA komplementarnego do wystających elementów złoża.
Pozostałe elementy przepływają przez kolumnę
Na kolumnie pozostają frakcje mRNA
Wiązanie między ogonkiem poliA a złożem- wodorowe, słabe, zrywane za pomocą np. soli o niskim stężeniu np. 0,5M-1M NaCl (przepłukiwanie kolumny)
... zobacz całą notatkę

Komentarze użytkowników (0)

Zaloguj się, aby dodać komentarz