To tylko jedna z 3 stron tej notatki. Zaloguj się aby zobaczyć ten dokument.
Zobacz
całą notatkę
Izolacja RNA z komórek eukariotycznych, otrzymywanie cDNA
1. Techniki izolacji RNA- zasady; wyjaśnić szczegółowo przebieg izolacji na zajęciach.
1) Rozmrażamy lizat komórek w odczynniku TRI- inaktywuje endogennych RNaz
tiocjanian guanidyny- inhibitor RNaz
fenol- do wytrącania na granicy faz
2) Przygotowujemy msce pracy bez-RNAzowej (trzeba się pozbyć RNaz egzogennych zewnątrzkomórkowych- w pocie, na rękach i endogennych wewnątrzkomórkowych):
stół przetrzeć odczynnikiem usuwającym RNAzy- zawiera DEPC eter dietylowy kwasu pirowęglowego
szkło, sprzęt, woda- DEPCowane i autoklawowane
rękawiczki 3) 1-bromo-3-chloropropan (halogenuje RNA, degraduje białka, działania jak chloroform)
4) Wir, oddzielenia RNA (faza górna) od DNA i białek (faza dolna i interfaza)
5) izopropanol- zmniejszenie rozpuszczalności RNA (precypitacja), RNA wytrąca się w postaci osadu. Wir
6) 75% etanol- doczyszczenie, przemywanie, odpłukanie resztek odczynników. Wir
7) Osad suszymy przy płomieniu palnika
8) Osad rozp w bez-RNazowej wodzie
Oprócz inhibitorów można zastosować:
podwyższoną temperaturę
proteinazę K- niszczy błony, białka enzymatyczne
merkaptoetanol, DTT- niszczą mostki disiarczkowe
RNazol- zamiast TRI
Izolacja mRNA z reszty RNA- mRNA a końcu 5' ma czapeczkę, a na końcu 3' ogonek poli(A). Sekwencja na końcu 3' może być związana przez sekwencję poli (T), która z kolei jest przyłączona do stałego podłoża w kolumnie chromatograficznej. Kiedy przez kolumnę przepuścimy RNA, w kolumnie zatrzyma się związane przez sekwencję poli(T) mRNA (na zasadzie hybrydyzacji zaadsorbuje się ogonek poli(A), pozostałe frakcje pozostają nie związane i w konsekwencji odmyte.
Metody izolacji RNA:
I już niestosowana
Lizowanie komórek w obecności proteinazy K i SDS
Oczyszczanie przez dodanie fenolu z chloroformem
Pozbycie się DNA przez dodanie DNaz
II Tiocjanian guanidyny w buforze lizującym
Oczyszczanie RNA przez gradient w chlorki cezu
III
Liza komórki w obecności tiocjanianu guanidyny
Oczyszczanie RNA za pomocą fenolu z chloroformem
Po co izolujemy RNA:
Określenie ekspresji genu na poziomie transkryptu
Poznanie struktury przestrzennej, sekwencji, funkcji biologicznej
Określenie czy dany gen jest aktywny w komórce, czy ulega transkrypcji
Tworzenie biblioteki cDNA
Do nothern blottingu
(…)
…. mRNA u eukariotów powstaje podczas transkrypcji jako heterogenne hnRNA (pre-mRNA), a następnie ulega obróbce posttranskrypcyjnej, podczas której dodawana jest czapeczka, wycinane są introny (splicing), i dodawany jest ogon poli-A.
rRNA- rybosomalny- wchodzą w skład rybosomów, które biorą udział w procesie biosyntezy polipeptydów. U eukariota za jego transkrypcję odpowiada polimeraza RNA I (wyjątek: 5S rRNA- polimeraza RNA III). rRNA występuje w rybosomach, u eukariontów także w jądrze komórkowym (jąderku).
tRNA- transportujący- przyłączanie wolnych aminokwasów w cytoplazmie i transportowanie ich do rybosomów, gdzie w translacji zostają włączone do łańcucha polipeptydowego. siRNA- małe interferujące- powoduje wyciszanie ekspresji genów o homologicznej sekwencji.
miRNA- mikro- regulują ekspresję innych genów. miRNA kodowane są przez genom komórki, jak normalne geny, i transkrybowane przez polimerazę RNA II.
snRNA- mały jądrowy i scRNA- mały cytoplazmatyczny- udział w procesach obróbki pierwotnego transkryptu.
3. Odwrotna transkrypcja w biologii molekularnej: zastosowanie, zasada, sposoby przeprowadzenia, szczegółowy opis przebiegu doświadczenia na ćwiczeniach.
Aby uniknąć degradacji RNA, możemy…
... zobacz całą notatkę
Komentarze użytkowników (0)