RNA, sem 5

RNA
Główne rodzaje RNA
-mRNA -1-5% komórkowego RNA
-tRNA -około 20%
-rRNA - 75% Metody izolacji RNA
1 Izolacja specyficznego RNA poprzez frakcjonowanie całego RNA komórki 2 bezpośrednia izolacja specyficznego RNA, ograniczona wyłącznie do komórek, które syntezują go do większej ilości
3 Izolacja poli (A)RNA
4 Izolacja RNA z polirybosomów
5 izolacja całkowitego RNA komórki , a następnie uzyskanie określonego RNA (cDNA) metodą PCR
Warunkiem uzyskanie dobrej jakości RNA jest szybkie i skuteczne zahamowanie działania rybonukleaz, które występują we wszystkich żywych komórkach i bardzo szybko degradują RNA. Do izolacji RNA wymagane jest przygotowanie sprzętu i odczynnika, powinny być przygotowane na wodzie do której wcześniej dodano DEPC (dityloprowęglan), który hamuje działanie rybonukleaz. Etapy izolacji RNA
liza komórek
inaktywacja rybonukleaz za pomocą fenozolu
dodanie chromoforu i wirowanie (RNA pozostaje w fazie górnej , a DNA i białka przechodzą do fazy dolnej)
Faze górną zbiera się i po dodaniu izopropanolu oczyszcza np. na złożu krzemionkowym (RNA osiada na złożu, a zanieczyszczenia przez nie przechodzą)
rozpuszczenie oczyszczonego RNA w wodzie (do RNaz)
... zobacz całą notatkę