Wykrywanie zmutowanego genu poprzez analizę polimorfizmu metodą PCR - wykład z biologii molekularnej

Nasza ocena:

5
Pobrań: 140
Wyświetleń: 2457
Komentarze: 0
Notatek.pl

Pobierz ten dokument za darmo

Podgląd dokumentu
Wykrywanie zmutowanego genu poprzez analizę polimorfizmu metodą PCR - wykład z biologii molekularnej - strona 1 Wykrywanie zmutowanego genu poprzez analizę polimorfizmu metodą PCR - wykład z biologii molekularnej - strona 2

Fragment notatki:

Wykrywanie zmutowanego genu poprzez analizę polimorfizmu metodą PCR-RFLP Polimorfizm genetyczny oznacza występowanie w populacji dwóch lub więcej alleli w danym locus, z częstotliwością większą niż wynikającą z częstości mutacji. Polimorfizmy są różnicami genetycznymi stanowiącymi o zróżnicowaniu wewnątrz gatunku. W praktyce ciężko jest ustalić jaka częstość allelu wynika z mutacji, dlatego często stosuje się drugą definicje polimorfizmu, wg której polimorfizm oznacza występowanie najczęstszego allelu w danym locus z częstością mniejsza niż 99%. Polimorfizm genetyczny może wynikać z różnic sekwencji DNA lub wielkości DNA spowodowanej różną liczbą powtórzeń charakterystycznych sekwencji DNA. Markerem genetycznym jest dziedziczna cecha genetyczna z łatwo rozpoznawalnymi allelami. Markery genetyczne przydatne są w badaniach rodzinnych i populacyjnych. Wszystkie polimorfizmy odzwierciedlają zmiany sekwencji DNA, a obecność takich zmian może być wykazana różnymi metodami. Polimorfizmy RFLP(polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych) są dziedzicznymi wariantami sekwencji DNA, które objawiają się utworzeniem lub zanikiem miejsca rozpoznawalnego przez endonukleazy restrykcyjne lub zmianą liczby nukleotydów między takimi miejscami. RLFP są przekazywane jako proste cechy kodominujące. Technika PCR-RLFP polega na amplifikacji fragmentu DNA, w obrębie którego występuje marker RLFP, a następnie jego trawieniu odpowiednim enzymem restrykcyjnym. W przypadku wykrywania mutacji PCR-RLFP jest techniką analizy bezpośredniej, tzn. prowadzi do wykrycia defektu genu. W przypadku analizy polimorfizmu jest metodą pośrednią, tzn identyfikuje zmutowany gen bez określenia podłoża mutacji. W tym podejściu wykorzystuje się informacje o sprzężeniu w danej rodzinie markera RLFP z chorobą. W analizie bezpośrednie konieczne jest dobranie enzymu restrykcyjnego rozpoznającego miejsce mutacji, co znacznie ogranicza stosowanie tego podejścia, szersze zastosowanie znajduje natomiast analiza pośrednia. Analizę RLFP można również zastosować w badaniach, w których sztucznie wprowadza się miejsce restrykcyjne w celu zidentyfikowanie mutacji. Obecnie PCR-RLFP stosowany jest dla wielu chorób genetycznych m.in. mukowiscydozy, fenyloketonurii, niedoboru alfa1-antytrypsyny, anemii sierpowatej, hemofilii, dystrofii mięśniowych, zespołu łamliwego chromosomu X. PCR-RLFP może być stosowana zarówno do bezpośredniego identyfikowania mutacji lub określenia nosicielstwa. W przypadku określenia nosicielstwa okres jednego tygodnia okres jednego tygodnia niezbędny do wykonania badania metodą transferu Southerna i hybrydyzacji z sondą molekularną, ulega skróceniu do kilku godzin przy zastosowaniu PCR.
Analiza polimorfizmu DNA metodą PCR-RFP:
1.Pobranie materiału 2.Izolacja DNA 3.PCR


(…)

… jednostronnego wybrzuszenia lub ugięcia nici DNA. Do wykrywania produktu stosowane jest zamiennie barwienie srebrem oraz zestaw do automatycznego sekwencjonowania ALFExpress. Molekularne podłoże powstawania heterodupleksów zostało wyjaśnione na podstawie badań heterodupeksów prawidłowego i zmutowanego genu CFTR, którego mutacje prowadzą do mukowiscydozy. Allel genu CFTR z mutacja (delecja fenyloalaniny 508…
… lub określenia nosicielstwa. W przypadku określenia nosicielstwa okres jednego tygodnia okres jednego tygodnia niezbędny do wykonania badania metodą transferu Southerna i hybrydyzacji z sondą molekularną, ulega skróceniu do kilku godzin przy zastosowaniu PCR.
Analiza polimorfizmu DNA metodą PCR-RFP:
1.Pobranie materiału 2.Izolacja DNA 3.PCR
4.Trawienie produktu PCR enzymem restrykcyjnym
5.Elektroforeza
Metoda…
… zastosowana do wykrywania mutacji w wielu genach jak również stanowiła główna metodę przesiewową przy poszukiwaniu nowych genów.
Wykrywanie polimorfizmu lub zmutowanych alleli zależy w znacznym stopniu od wysokorozdzielczej elektroforezy w żelach poliakrylamidowych. W przypadku chorób uwarunkowanych mutacjami dziedzicznymi, w układnie heterozygotycznym występują dwa allele: jeden zmutowany a drugi prawidłowy…
… jednostronnego wybrzuszenia lub ugięcia nici DNA. Do wykrywania produktu stosowane jest zamiennie barwienie srebrem oraz zestaw do automatycznego sekwencjonowania ALFExpress. Molekularne podłoże powstawania heterodupleksów zostało wyjaśnione na podstawie badań heterodupeksów prawidłowego i zmutowanego genu CFTR, którego mutacje prowadzą do mukowiscydozy. Allel genu CFTR z mutacja (delecja fenyloalaniny 508…
... zobacz całą notatkę



Komentarze użytkowników (0)

Zaloguj się, aby dodać komentarz