Mutacje i polimorfizm w diagnostyce klinicznej - wykład z biologii molekularnej

Nasza ocena:

5
Pobrań: 112
Wyświetleń: 1792
Komentarze: 0
Notatek.pl

Pobierz ten dokument za darmo

Podgląd dokumentu
Mutacje i polimorfizm w diagnostyce klinicznej - wykład z biologii molekularnej - strona 1 Mutacje i polimorfizm w diagnostyce klinicznej - wykład z biologii molekularnej - strona 2

Fragment notatki:

Mutacje i polimorfizm w diagnostyce klinicznej. Olbrzymi postęp w identyfikacji i klonowaniu genów odpowiedzialnych za szereg chorób dziedzicznych wymagał rozwój metod umożliwiających mutację. Określenie sekwencji nukleotydów jest najbardziej bezpośrednim podejściem wykrywania mutacji, jednak metoda ta jest zbyt kosztowana aby wykonywać ją na rutynowo. W przypadkach gdy poszukuje się mutacji w dużej liczbie chorych, korzysta się z technik pozwalających na wstępne wyselekcjonowania zmienionych fragmentów DNA do analizy sekwencyjnej. Do najczęściej stosowanych metod wstępnej selekcji należą analiza heterodupleksów (HD), polimorfizm konformacji jednoniciowych DNA (SSCP), elektroforeza w gradiencie czynnika denaturującego (DGGE), chemiczna lub fizyczna analiza niesparowań. Badanie polimorfizmu konformacji jednoniciowych fragmentów DNA (SSCP ang. single strand conformation polymrphism) jest jedną z najczęściej stosowanych technik elektroforetycznych umożliwiających wykrywanie punktowych zmian DNA. Materiałem wyjściowym do analizy SSCP są produkty PCR, które przed elektroforezą denaturuje się termicznie w buforze obciążającym z dodatkiem czynnika denaturującego - formamidu z dodatkiem mocznika lub wodorotlenku sodowego. Rozdział tak przygotowanych produktów PCR prowadzi się w tzw. natywnym żelu poliakrylamidowym czyli takim, który nie zawiera żadnego czynnika denaturującego. W warunkach natywnej elektroforezy jednoniciowa cząsteczka DNA tworzy wewnętrzne sparowania, przez co przyjmuje określona konformację przestrzenną zależną od sekwencji nukleotydowej. Szybkość migracji jednoniciowych fragmentów DNA zależy od wielkości oraz konformacji. Fragmenty o takiej samej wielkości i sekwencji nukleotydów przyjmują takie same konformacje, a więc migrują z taką samą szybkością. Fragment zmutowany tworzy inny niż prawidłowe wzory SSCP, ponieważ tworzy inne konformacje migruje ze zmienioną szybkością. Jedna cząsteczka może przybierać kilka konformacji, ponieważ jedną z nich tworzą preferencyjnie, co jest widoczne na żelu w postaci jednego wyraźnego sygnału i kilku sygnałów słabszych. Zmiana intensywności sygnałów, wynikająca ze zmian preferencji tworzenia konformacji również może wskazywać na mutację w badanym fragmencie DNA.
Teoretycznie wystarczy zmiana jednego nukleotydu, aby fragment przyjął inna konformację a tym samym migrował z inną szybkością. W praktyce jednak technika ta nie wykrywa wszystkich zmian sekwencji. Najlepsze wyniki, ponad 95% wykrywalności zmian, osiąga się dla fragmentów DNA o wielkości 100-300 par zasad. Dla odcinków 300-450 par zasad wykrywalność spada poniżej 80%. Dłuższe produkty PCR przed elektroforeza można trawić enzymem restrykcyjnym tak dobrany aby otrzymać do analiz SSCP fragmenty DNA o optymalnej wielkości. Jeszcze innym podejściem jest RF-SSCP. Polega on na równoległym trawieniu dużego produkty PCR (ok 1000pz) kilkoma enzymami restrykcyjnymi. Każdy z enzymów tworzy inną mieszaninę fragmentów o różnej wielkości. Część z uzyskanych fragmentów restrykcyjnych jest za mała lub za duża do optymalnej jakości SSCP, jednak wśród nich znajdują się również fragmenty odpowiednie. Porównanie wzorów SSCP otrzymanych po trawieniu np. pięcioma enzymami pozwala wyselekcjonować fragment z mutacją.


(…)

… fragment z mutacją.
Na jakość i wydajność tworzenia konformantów ma wpływ wiele czynników jak: temperatura, stężenie DNA, siła jonowa buforu, usieciowanie żelu, stężenie glicerolu w żelu. Szczególnie ważnym parametrem jest temperatura która nie powinna przekraczać 20' C. Przy zbyt wysokim stężenie DNA w próbie większa część jednoniciowych fragmentów renaturuje w cząsteczki dwuniciowe. Lepsze rozdziały…
... zobacz całą notatkę



Komentarze użytkowników (0)

Zaloguj się, aby dodać komentarz