To tylko jedna z 3 stron tej notatki. Zaloguj się aby zobaczyć ten dokument.
Zobacz
całą notatkę
Transformacja komórek kompetentnych. Wstęp teoretyczny Transformacja DNA - polega na zmianie genomu komórkowego na skutek pobrania cząsteczek DNA ze środowiska. Termin transformacja stosuje się powszechnie do określenia trwałej zmiany zapisu genetycznego komórki i jego wpływu na cechy komórki tak u organizmów prokariotycznych, jak i u eukariotycznych. Kontrolowaną transformację bardzo często stosuje się w celu uzyskania szczególnych szczepów bakteryjnych. W tym celu obcy DNA przy pomocy wektora (np. plazmidu) wprowadza się do kompetentnych komórek bakteryjnych. Gatunkiem najczęściej stosowanym w transformacji jest Escherichia coli. Najpopularniejszymi metodami tranfromacji używanymi w mikrobiologii są elektroporacja oraz transformacja z uzyciem PEG. Obie techniki polegają na utworzeniu mikroporów w membranach komórki, dzięki czemu wektor ze środowiska może wniknąć do wnętrza i zostać przyjęty przez komórkę gospodarza. X-gal- dwucukier, podobny do laktozy, naturalnego substratu b-galaktozydazy .Enyzm dzieli X-gal na dwa cukry składowe , z których jeden ma niebieską barwę . Kolonie bez wstawki DNA stają się niebieskie , a zawierające zrekombinowany wektor pozostają kremowobiałe.
IPTG jest analogiem laktozy, nie hydrolizowany przez β-galaktozydazę, hamuje działanie represora lac indukuje on ekspresje lac E. coli i produkuje nadmiar β-galaktozydazy. Ampicylina jest czynnikiem selekcyjnym, we wprowadzonym plazmidzie znajduje się gen AmpR oporności na ampicylinę. Komórki które nie uległy transformacji nie wykazują oporności i w prosty sposób są eliminowane. Przebieg ćwiczenia 1. Bezpośrednio po wyjęciu z -80stC komórki kompetentne umieściliśmy na lodzie do rozmrożenia. 2. Do komórek dodaliśmy 1-500ng DNA (w niniejszym ćwiczeniu: połowę objętości ligacji 10 µl), delikatnie wymieszaliśmy i zostawiliśmy na lodzie na 30 min. 3. Umieściliśmy w 42 st.C (łaźnia wodna) dokładnie na 1,5 minuty. 4. Wyjęliśmy z łaźni, umieściliśmy na lodzie na 3 min. 5. Jeśli dodana została mieszanina plazmidów (jak w przypadku ligacji), wymagany jest dodatkowy skrining. Do probówek z komórkami należy dodać 1 ml pożywki LB* (bez ampicyliny) i inkubować komórki z wytrząsaniem przez 1 godzinę w 37 st.C.W celu lepszego napowietrzania pożywki probówki należy ułożyć poziomo w wytrząsarce. 6. W tym czasie przygotowaliśmy płytki z pożywką LB zestaloną agarem. Wyjęliśmy z lodówki, ogrzaliśmy do temp. pokojowej. Płytki dokładnie opisaliśmu(patrz pkt 8 protokołu). 7. Po inkubacji komórki wirowaliśmy przez 10 sekund (6500 obr./min.). Zlaliśmy ostrożnie nadsącz, osad komórek rozpuściliśmy w 100μl pożywki LB (z ampicyliną). Delikatnie wymieszaliśmy.
... zobacz całą notatkę
Komentarze użytkowników (0)