To tylko jedna z 3 stron tej notatki. Zaloguj się aby zobaczyć ten dokument.
Zobacz
całą notatkę
Transfekcja komórek eukariotycznych
1. Sposoby wprowadzania obcego DNA do komórek eukariotycznych.
Transformacja- proces przenoszenia materiału genetycznego jednej komórki (dawcy) do drugiej komórki (biorcy) bezpośrednio ze środowiska zewnętrznego, bez wytworzenia fizycznego kontaktu między dawcą a biorcą i bez obecności wektora przenoszącego materiał genetyczny. Fragmenty pobranego DNA zostają wbudowane w DNA biorcy i organizmy te uzyskują cechy komórek dawcy. Kompetencja- zdolność do pobrania DNA z otaczającego środowiska.
Transdukcja- proces polegający na przenoszeniu materiału genetycznego z komórki dawcy do komórki biorcy za pośrednictwem bakteriofagów. 1) Zakażenie komórki przez faga. 2) Kwasy nukleinowe bakteryjne i bakteriofagowe zostają pocięte przez enzymy wirusowe. 3) Synteza części składowych wirusa. 4) Kompletne wiriony opuszczają komórkę bakteryjną. 5) Bakteriofag niosący bakteryjny DNA zakaża kolejną bakterię. 6) DNA od dawcy zostaje wstrzyknięte do komórki bakterii- biorcy. 7) DNA z komórki faga zastępuje fragment DNA bakterii. Rodzaje transducji:
ogólna- za pomocą faga może być przeniesiony z komórki dawcy do biorcy dowolny gen
poronna (aboratywna)- przeniesiony przez faga DNA dawcy nie zostaje wbudowany do chromosomu biorcy i pozostaje niezintegrowany w cytoplazmie. specyficzna (ograniczona)- fagi łagodne przenoszą materiał genetyczny ze zdolnością ograniczoną do jednej cechy.
Transfekcja- proces wprowadzenia obcego, koliście zamkniętego DNA lub RNA do komórki eukariotycznej, gdzie ulaga on powieleniu (matoda bezwektorowa):
stabilna- połączona z integracją DNA do genomu
przejściowa- gdy cząsteczka DNA nie ulegnie integracji, ekspresja wprowadzonego genu zostanie zgubiona w miarę podziałów komórkowych- nie będzie przekazywana
2. Klasyfikacja technik transfekcji.
Metody transfekcji:
I Fizyczne:
1) mikroiniekcja- r-ór DNA jest wstrzykiwany bezpośrednio do jądra komórkowego lub w przypadku RNA do cytoplazmy, za pomocą szklanej kapilary.
2) elektroporacja- transfekcja za pomocą krótkotrwałego szoku elektrycznego w r-rze zawierającym kw nukleinowy. Szok elektryczny powoduje przejściowe utworzenie w błonie komórkowej mikroporów, przez które może się dostać materiał genetyczny
3) mikrowstrzeliwanie- strzelba genowa- wstrzeliwanie do wnętrza komórki mikrokulek złota opłaszczonych DNA
4) infiltracja próżniowa- komórki zanurzone są w podłożu z kw nukleinowymi i umieszczane w atmosferze o znacznie obniżonym ciśnieniu, co powoduje wyssanie powietrza z przestworów międzykomórkowych i ułatwia wnikanie kw nukleinowych
(…)
… w terapii genowej/komórkowej, poprzez wprowadzenie DNA do uszkodzonych komórek, Wyróżniamy 3 rodzaje terapii:
wzmacniającą (wzmocnienie ekspresji genu)- w leczeniu nowotworów i chorób układu krążenia
substytucyjna (wprowadzanie brakującego genu)- choroby dziedziczne: wrodzone błędy metaboliczne czy dystrofia mięśniowa.
hamująca (hamowanie ekspresji genów, przy pomocy: oligonukleotydów antysensownych)- nowotwory i choroby układu krążenia
…
… się kompleksu i większa wydajność transfekcji
wydajność transfekcji jest wyższa w obecności surowicy ze względu na lepsze przeżycie komórek
4. Zastosowanie ludzkich linii komórkowych w biologii eksperymentalnej ze szczególnym uwzględnieniem linii wykorzystanej na zajęciach.
Linia komórkowa wykorzystywana na zajęciach: linia A549 komórek niedrobnokomórkowego raka płuc- testowanie nowych leków w walce z rakiem
Linia komórkowa:
kultura dzielących się komórek, powstałych z podziału 1 lub kilku komórek wyselekcjonowanych z organizmu wielokomórkowego
grupa komórek o podobnej budowie i właściwościach powstających w wyniku podziałów pojedynczej komórki macierzystej
Zwykle komórka macierzysta posiada określone właściwości lub zmieniony materiał genetyczny. Zmienione komórki macierzyste powstają w laboratoriach…
…, białka: protamina, histony, ludzka albumina
- polimery i kopolimery kationowe- naturalne: chitozan, syntetyczne: polietylenoimina PEI, poli-β-aminoestry
- dendrymery- wysokocząsteczkowe polimery o dobrze zdefiniowanej architekturze, wyróżniające się jednorodnością i rozkładem ładunków np. polimery poliamidoaminowe
III Wirusowe:
1) adenowirusy- wnikają do nie dzielących się komórek, wywołują niepotrzebną…
… endocytozy
2) syntetyczne nośniki DNA- niewirusowe nośniki DNA obdarzone ładunkiem dodatnim:
Jony Ca2+
Lipopleksy:
- lipidy i liposomy kationowe (Liposomy- sferyczne dwuwarstwowe struktury składające się z cząsteczek lipidu obdarzonego ładunkiem „+” i cząsteczek lipidu obojętnego elektrostatycznie, np. lipofektyna DOTMA)
Polipleksy:
- kationowe polipeptydy i białka np. poli-L-lizyna PLL, poli-L-ornityna…
... zobacz całą notatkę
Komentarze użytkowników (0)