Ocena wydajności transformacji - ćwiczenie

Nasza ocena:

5
Pobrań: 210
Wyświetleń: 4550
Komentarze: 0
Notatek.pl

Pobierz ten dokument za darmo

Podgląd dokumentu

Fragment notatki:

Ocena wydajności transformacji. Izolacja pojedynczych kolonii. Wstęp teoretyczny Wydajność transformacji definiuje się jako liczbę kolonii (CFU - colony forming units) powstających po transformacji bakterii kompetentnych 1ug plazmidowego DNA (plazmid w formie superzwiniętej zamkniętej, CCC). W praktyce oznaczamy tę wydajność transformując bakterie znacznie mniejszą ilością DNA (ok. 0.1 ng) gdyż tylko wtedy ilość kolonii jest policzalna i są one wystarczająco rozproszone. Na późniejszym etapie przeliczamy tę liczbę dla CFU dla wartości 1ug DNA. Do oznaczania wydajności transformacji używami plazmidu kontrolnego tj. czystego wektora (a nie mieszaniny ligacyjnej). Wzór do obliczenia wydajności transformacji: Przebieg ćwiczenia: 1. Przygotowaliśmy stanowisko pracy: przetarliśmy stół laboratoryjny alkoholem etylowym 70%, zapaliliśmy palnik; odczekaliśmy chwilę, aby płomień wyjałowił atmosferę. 2. Przygotowaliśmy odpowiednią ilość pożywki LB, wysterylizowaliśmy przez autoklawowanie. Po wystudzeniu do ok. 50 stC dodaliśmy ampicylinę, aby końcowe stężenie w pożywce wynosiło 50 ug/ml. 3. Do sterylnych probówek o pojemności 50ml, nakrytych folią aluminiową, nalaliśmy pipetą serologiczną po 5ml pożywki LB. Zachowaliśmy sterylność, pracowaliśmy w atmosferze płomienia palnika. 4. Za pomocą sterylnej końcówki lub sterylnej wykałaczki pobraliśmy pojedynczą kolonię z płytki z agarem i umieścić w płynnej pożywce LB/amp. 5. Probówkę zamknęliśmy folią aluminiową i umieściliśmy w wytrząsarce w 37 st. C na noc. Ustawiliśmy wytrząsarkę na 200-250 obr/min.
Wynik a)
Wydajność transformacji wynosi 1964* b) W wyniku transformacji w temp 37  C na pożywce LB otrzymaliśmy białe i niebieskie kolonie. Obecność białych kolonii świadczy o prawidłowym przebiegu procesu transformacji.
Ilość posianej hodowli
Wyrosłe kolonie
15 µl
1 - białe
6 - niebieskie
85 µl
1 - białe
11- niebieskie
... zobacz całą notatkę



Komentarze użytkowników (0)

Zaloguj się, aby dodać komentarz