Ligacja T-vectora i insertu. Wstęp teoretyczny Ligazy DNA są enzymami łączącymi dwa fragmenty DNA poprzez tworzenie wiązań fosfodiestrowych między grupą OH deoksyrybozy i grupą fosforanową (P)dwuniciowego DNA przy wykorzystaniu energii z hydrolizy ATP lub NAD + .Najczęściej stosowanym enzymem do przeprowadzenia reakcji ligacji jest ligaza DNA bakteriofaga T4. Ligacja lepkich końców DNA jest znacznie wydajniejsza od ligacji tępych końców.
Dzieje się tak, dlatego że pomiędzy komplementarnymi jednoniciowymi fragmentami na
lepkich końcach cząsteczek DNA tworzą się wiązania wodorowe. Wiązania te przytrzymują
razem oba końce, co ogromnie ułatwia reakcję ligacji. Swobodne tępe końce rzadko znajdują
się w tak blisko siebie, by ligacja stała się możliwa.
Przebieg ćwiczenia Postępujemy zgodnie z poniższym protokołem:
http://www.fermentas.com/en/products/all/molecular-cloning/enzymes/el001-t4-dna-ligase Wynik Zlinearyzowany wektor:
8 ng - 1 µl
100 ng - x X = 12,5 µl
Wstawka:
10 ng -1 µl
38,5 - x
X=3,85 µl
Mix reakcyjny:
Zlinearyzowany wektor - 12,5 µl
Wstawka - 3,85 µl Bufor ligazy T4 DNA 10X - 2 µl
Ligaza T4 DNA 1u - 0,2 µl (dodano 0,5 µl)
Woda -1,15 µl Przygotowaliśmy 20 ul roztworu ligacyjnego. Połowę mieszaniny ligacyjnej wykorzystaliśmy do transformacji komórek kompetentnych E.coli.
... zobacz całą notatkę
Komentarze użytkowników (0)