To tylko jedna z 3 stron tej notatki. Zaloguj się aby zobaczyć ten dokument.
Zobacz
całą notatkę
Klonowanie sekwencji genomowej w wektorze reporterowym
1. Opis użytego do klonowania wektora reporterowego.
Plazmidowy wektor pGL3-Basic- przenosi naszą amplifikowaną sekwencję do bakterii:
Ampr - gen warunkujący odporność na ampicylinę u E. coli- gen selektywności, który pełni rolę markera transformacji, umożliwia selekcję komórek posiadających plazmid
f1 ori- początek replikacji uzyskany z fagów
ori- miejsce inicjacji replikacji (plazmid musi być zdolny do samoreplikacji). U Prokaryota jest to jedno miejsce, u Eukaryota wiele miejsc
polilinker (MCS)- odcinek DNA zawierający sekwencje rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne (SacI i HindIII), które rozcinają wektor, co umożliwia wbudowanie wstawki- insertu (produktu reakcji PCR). Na końcach fragmentu, który zamplifikowaliśmy też są sekwencje rozpoznawane przez te enzymy restrykcyjne
luc+ - zmodyfikowana sekwencja kodująca lucyferazę świetlika (marker- lucyferaza katalizuje reakcję utleniania lucyferyny, podczas której emitowane jest światło)
gen β-laktamazy (Ampr)
strzałki- kierunek transkrypcji
2. Uzasadnienie wyboru enzymów restrykcyjnych do klonowania oraz składu mieszaniny restrykcyjnej.
SacI i HindIII: na wektorze i we wstawce są takie same sekwencje, które są rozpoznawane przez te enzymy. Umożliwia to powstanie takich samych komplementarnych, lepkich końców we wstawce i w plazmidzie, co ułatwia kierunkowe wstawienie insertu do plazmidu. (końce tępe- klonowanie bezkierunkowe)
Mieszanina restrykcyjna- powinna zawierać takie związki i substancje, dzięki którym enzym osiągnie optymalną aktywność. W przypadku stosowania 2 lub więcej enzymów należy dobrać takie warunki, aby każdy z enzymów osiągnął możliwie największą aktywność (wszystkie enzymy restrykcyjne wymagają Mg2+, ale różne enzymy wymagają do optymalnej aktywności różnego pH, stężenia NaCl lub obecności innych składników buforu). bufor Tango- zapewnia najwyższą aktywność obu enzymów. Zawiera jony Mg2+, NaCl, albuminę surowicy bydlęcej. (pH 7,5, temp 37oC)
enzym SacI
enzym HindIII
preparat wektora
preparat wstawki
woda
3. Opis użytych do klonowania enzymów restrykcyjnych.
SacI i HindIII- enz restrykcyjne klasy II. rozpoznają sekwencję palindromową w dwuniciowym DNA i przecinają cząsteczkę w jej obrębie lub w określonej odległości od niej
wymagają jonów Mg2+ jako kofaktorów
mają aktywność endonukleazy i metylazy
dezaktywacja enzymów- 65˚C
SacI: Rozpoznawana sekwencja: 5' GAGCTC 3' którą tnie: 5' GAGCT C 3'
(…)
….
Etapy transformacji:
1) Sorpcja DNA na powierzchni komórki bakteryjnej
2) Transport zaadsorbowanej cząsteczki do wnętrza komórki
3) Włączenie DNA do genomu
4) Fenotypowe wyrażanie nowej cechy
Po transformacji bakterie wysiewa się na odpowiednie podłoże selekcyjne. Selekcja opiera się na obecności w wektorze genu selektywnego (markerowego), który nadaje transformatom określony fenotyp. Na wektorze…
…, które powstały na skutek trawienia identycznymi enzymami restrykcyjnymi
5. Opis zasady elektroforezy preparatywnej (izolacji DNA z żelu agarozowego).
Elektroforeza- to rozdział cząsteczek dodatnio lub ujemnie naładowanych w wyniku migracji w polu elektrycznym. Przebieg elektroforezy można monitorować nanosząc (na osobnych ścieżkach lub razem z preparatem) specjalne barwniki o znanej mobilności elektroforetycznej. Po zakończeniu procesu żel wydobywa się z aparatu i analizuje przez wybarwienie (u nas roztworem błękitu metylenowego przez 20 minut). Do barwienia można też użyć bromku etydyny, który interkaluje pomiędzy zasady azotowe. Widzimy więc kompleks DNA z bromkiem etydyny, bo tam świecenie jest 20x więsze. Następnie wypłukuje się barwnik. Elektroforeza preparatywna- umożliwia izolację tej części…
... zobacz całą notatkę
Komentarze użytkowników (0)