Inżynieria genetyczna- wykład 4

Nasza ocena:

5
Pobrań: 504
Wyświetleń: 2205
Komentarze: 0
Notatek.pl

Pobierz ten dokument za darmo

Podgląd dokumentu
Inżynieria genetyczna- wykład 4 - strona 1 Inżynieria genetyczna- wykład 4 - strona 2 Inżynieria genetyczna- wykład 4 - strona 3

Fragment notatki:

fragment
DNA M13
amp R
3997 bp
lacZ’
pEMBL8: wektor hybrydowy (fagemid)
→ Posiada zalety M13, ale jednocześnie pozwala
na wklonowanie dłuższych fragmentów.
• wektor jest hybrydą faga i plazmidu (w tym przypadku faga M13 i typowego plazmidu, np z serii PUC)
• posiada oporność na ampicylinę (amp), miejsce
ori, lacZ’ (jak w każdym plazmidzie)
• fragment DNA M13 – zawiera wszystkie sekwencje
potrzebne do tego, aby mogła powstać pojedyncza nić
Kiedy potrzebujemy otrzymać DNA w postaci pojedynczej nici (w formie kolistej), wtedy komórki, które
posiadają dany plazmid muszą być zakażone fagiem
pomocniczym. Fag pomocniczy dostarcza wszystkich
białek potrzebnych do tego, aby na matrycy fagemidowej mogła rozpocząć sę synteza pojedynczej nici
DNA. Fag pomocniczy jest tak skonstruowany, że jego
DNA nie podlega replikacji i mapowaniu w białkach
osłonkowych, które również dostarcza.
Konwersja pEMBL8 do jednoniciowego DNA
M13
region
Dwuniciowe
pEMBL8
Liza gospodarza
pEMBL8
Pierwszy problem rozwiązano za pomocą znajomości genomu faga λ – geny są pogrupowane i szczęśliwie
okazało się, że w środkowej części znajdują się geny,
które są zbędne dla faga o funkcji wektora
Synteza DNA
09.03
Wczesna regulacja
Wykład 4
• możliwość usunięcia do 15 kb, a zatem insert
może mieć do 18 kb
• zostaje wycięty fragment odpowiedzialny za
możliwość istnienia faga w formie litycznej
Drugi problem rozwiązano posługując się selekcją
naturalną. Infekowano E. Coli szczepem dzikim faga
λ. Zauważono, że po pewnym czasie liczba miejsc restrykcyjnych się zmniejsza – fag się uodparnia, następują naturalne mutacje. Następnie infekowano komórki
fagiem λ o zmniejszonej ilości miejsc restrykcyjnych
aż do uzyskania faga λ, którego DNA nie ulega przecięciu.
Rodzaje wektorów faga λ:
• wektory inserycjne
• wektory zastępcze
Wektor insercyjny
• krótszy fragment
• jedno miejsce restrykcyjne !
Normalne DNA
(49 kb)
wektor insercyjny
(35–40 kb)
λgt10
• zostało wygenerowane miejsce EcoR1 do klonowania
• dokładnie znana długość wektora (40 kb)
• selekcja rekombinantów polega na zmianie fenotypu łysinek (miejsce klonowania jest zlokalizowane
w obrębie genu kodującego λ represor)
gt10
Klonowanie wektorów bazujących na fagu λ
Przed skonstuowaniem tych wektorów trzeba było rozwiązać dwa problemy:
• wielkość – istnieją pewne granice wielkości cząsteczek, jakie mogą być pakowane we wnętrzu główki
faga (3 kb – 52 kb)
• miejsca restrykcyjne – enzymy restrykcyjne tną
cząsteczkę w wielu miejscach i staje się ona bezużyteczna, chociaż enzymy restrykcyjne są uznawane za
unikatowe.
Eco RI
Delecja
40 kb
cl
λ2APII
• podobna długość wektora
• selekcja polega na selkcji biało-niebieskiej (lacZ’)
ZAPII
lacZ’
P
41 kb
Delecja
Wektory zastępcze
Cosmid
Typowy cosmid
• dwa miejsca restrykcyjne !
• w miejsca Stuffer’a wchodzi nowe DNA
Bam HI
amp
R
pJB8
5.4 kb
Restrykcja, ligacja
cos
DNA
ori
Nowe DNA
fragment
• plazmid, który zawiera sekwencję faga λ i miejsce cos
• względnie duży
• pozwala na klonowanie fragmentów ponad 40 kb
Eco RI, Bam HI, Sal I
lub kombinacja
RBS
Nowe DNA, do 23 kb
SBR
R = Eco RI B = Bam HI S = S al I
Bam HI
Dlaczego nie można skorzystać z pierwszej metody?
amp
R
Bam HI
Po usunięciu miejsc Stuffer’a i samoligacji otrzymamy fragmenty krótsze niż 3 kb. Dlatego w miejsce
Stuffera musi wejść nowe DNA.
Restrykcja
Bam HI
Kolisty
pJB8
Bam HI
amp
cos
R
cos
Liniowe pJB8
λEMBL4
• może przyjmować bardzo duże nowe fragmenty
DNA (23 kb)
• selekcja przez wielkość lub fenotyp SPI
Bam HI Bam HI
Ligacja
Nowe DNA
Bam HI
cos
Po co jest potrzebny Stuffer?
Bam HI Bam HI
amp R
Nowe
DNA
cos
Katenany
Paczka in vitro
Do otrzymania wektora w dostatecznej ilości do
klonowania (bez Stuffera nie mógłby się namnażać, bo
byłby za krótki)
Rekombinowane
DNA cosmidu
Infekcja E. coli
W jaki sposób klonujemy przy użyciu wektorów faga λ
• Klonowanie przy użyciu kolistego λ DNA (rzadko)
Eco RI
Eco RI
Eco RI
Nowe DNA
Eco RI
Eco RI, ligacja
cos
cos
Transfekcja
do E. coli
Rekombinant
– forma cykliczna
• Klonowanie przy użyciu liniowego DNA λ
• otrzymujemy duże fragmenty DNA zmodyfikowanego faga λ, ale z niego jest jedynie fragment cos oraz
białka osłonkowe, cała reszta jest rekombinowana
• co jest jeszcze ważne: komórka nie ulega lizie!
Podsumowanie: najkrótsze są wektory M13, potem
wektory plazmidowe (8 kb), wektory faga λ (20 kb),
wektory cosmidowe (40 kb)
Można oszacować ilość klonów, aby gen wystąpił
z dobrej strony z prawdopodobieństwem.
N =
ln(1
( )
ln 1
cos
cos
Eco RI
Eco RI
Eco RI
cos
Ligate
cos
cos
cos
Katenany
p)
a
b
N – liczba klonów
P – prawdopodobieństwo wystąpienia każdego genu
a – średnia wielkość fragmentu
b – całkowita wielkość genomu
W jaki sposób znaleźć konkretny klon w bibliotece
genów?
Eco RI
Nowe DNA
mieszanka reakcji
pakowania in vitro
Rekombinant
Infekowanie E. coli
długość jest określona przez miejsca cos (zatem określają one upakowanie).
Potrzeba znalezienia wektorów, które przenoszą
większe fragmenty (o tym będzie mowa później)
Problem selekcji: jeśli chcemy otrzymać bibliotekę,
to DNA przed otrzymaniem biblioteki zwykle ulega
fragmentacji. Mamy w bibliotece kolekcję fragmentów
DNA w poszczególnych klonach. W jednym z klonów
jest poszukiwana informacja.
Selekcja bezpośrednia
Jest prowadzona już na etapie hodowli komórek, przeżywają tylko te, które mają być wyselekcjonowane.
• wygodna i skuteczna
rekombinant
tet R
LEU2
Transformacja
E. coli
amp R
Samozligowany
wektor
Klony E. coli
Różne sposoby fragmentacji DNA
• mechaniczne (np. ultradźwiękami powodujemy
pękanie DNA)
• trawienie DNA enzymem restrykcyjnym (wyczerujące trawienie) polega na dodaniu takiej ilości
enzymu, że wszystkie miejsca ulegają restrykcji). Czasem mogą powstać zbyt krótkie fragmenty nie ligujące
z wektorem – częśći DNA trawione.
• lepsza metoda: Trawienie niewyczerpujące.
Otrzymujemy fragmenty których DNA się powtarzają,
ale sekwencje mają być różne.
Następnie przeprowadza się elektroforezę, wybiera
framenty o konkretnych dłgościach i liguje z wektorem. Czy nie odrzucimy zatem części istotnego materiału? Otóż nie!
Jak zredukować ilość materiału genetycznego, która
jest nam zbędna?
→ do tego służy biblioteka cDNA – odpowiada informacji jaka ulega ekspresji w komórce (nie zawiera
całej informacji genetycznej).
- brak leucyny
Geny ciche
Selekcja pośrednia
Musimy zidentyfikować klon w bibliotece genów.
• Przykład: Plazmid R6-5
Posiada oporność na działanie kalamicyny.
Doświadczenie: plazmid trawiony enzymem restrykcyjnym, który nie trawi interesującego nas genu
oporności na kanamicynę (EcoRI). Ligujemy strawione
fragmenty z wektorem pBR322 i wysiewamy na podłoże selekcyjne z kanamicyną. Pozostają tylko klony
posiadające gen oporności na kanR.
• Szczep auksotroficzny w odniesieniu do Trp
(wymaga obecności Trp w pożywce)
Doświadczenie: Dysponujemy szczepem E. Coli,
który jest zmutowany pod {...}
{...} gen za to odpowiedzialny?
Konstruujemy bibliotekę szczepu dzikiego E. Coli.
Trawimy DNA bakterii i otrzymujemy fragmenty
z  oraz bez genu, zwane TrpA. Ligujemy do wektora
i transformujemy komórki. Następnie wysiewamy je na
podłoże bez Trp. Przeżyją tylko rekombinanty TrpA+.
Używana również w komórkach drożdżowych.
Praktyczne aspekty tworzenia bibliotek
Rozróżniamy biblioteki genomowe oraz biblioteki cDNA.
• Biblioteka genomowa zawiera całą informację
genetyczną właściwą danemu organizmowi.
• Jak powstaje? DNA poddawany jest fragmentacji
i fragmenty o określonej długości są wybierane i ligowane z wektorem.
Komórka typu A
Geny ciche
Komórka typu B
Różne geny są ekspresjonowane w różnych typach
komórek. Część genów nie ulega ekspresji konstytutywnej tylko od czasu do czasu.
Ogólnie bibiloteka cDNA zawiera informacje o transkryptach. Każdy gen posiada wiele transkryptów, a zatem biblioteka cDNA jest dużo bardziej złożona.
Zakłada się często, że transkrypty posiadają {...}
Do transkryptu jest hybrydyzowana sonda, starter
który jest poliogonem T, komplementarny do poliogona A. Cząsteczki RNA są niestabilne, więc biblioteka
transkryptów jest przetwarzana na DNA. Po przyłączeniu startera z ogonem poli(T) używana jest odwrotna
transkryptaza (korzystając z matrycy RNA syntezuje
DNA). Zsyntezowana nić DNA nosi nazwę pierwszej
nici cDNA (komplementarny DNA). Ta cząsteczka
również jest nietrwała. Potrzebujemy nić dsDNA. Mu-
simy usunąć nić RNA. Używamy do tego RNazyH1
(RNaza, która hydrolizuje RNA, brak większej specyficzności). RNA ulega fragmentacji. Pozostają tylko
krótkie fragmenty połączone oddziaływaniami Watsona Cricka. Następnie używamy polimerazy DNA typu
I (może korzystać ze starterów, które są RNA i może
syntezować nić komplementarną), która wykorzystuje pozostałe fragmenty RNA. Polimeraza ta posiada
trzy aktywności: (1) polimerazową, (2) korekcyjną,
(3) nukleazową. Otrzymujemy ostatecznie cząsteczkę
dsDNA. Następnie już ligacja z wektorem i transformacja komórek. Jest to biblioteka, która zawiera tylko
sekwencje kodujące białek, które pojawiają się w danym momencie w komórce.
Bardzo istotny jest dobór komórek, które powinny
być wyspecjalizowane w syntezie białek (konkretnych).
Identyfikacja klonu (metody pośrednie)
• Hybrydyzacja kwasów nukleinowych (oddziaływania Watsona-Cricka)
Niestabilna hybryda
Do jakich metod może być użyty tyen izotop fosforu
w pozycji d2?
→ do znakowania w translacji NIC (polimeraza
DNA I, która wykorzystuje aktywność 5’→3’ nukleazową). Musimy dysponować cząsteczką DNA,która
ma szereg pęknięć.
Można również zaznakować końce cząsteczki DNA
(tak zwane wypełnianie końców), używając fragmentów Klenowa.
Znakowanie przy użyciu starterów o przypadkowych sekwencjach. Jako substrat wykorzystujemy
cząsteczkę dsDNA, która jest następnie denaturowana. W  roztworze są obecne również krótkie oligonukleotydy (heksomeryczne), w różnym nadmiarze. Przy
obniżaniu temperatury, oligonkuleotydy będą hybrydyzowały przypadkowo i tylko te, które są komplementarne. Pełnią funkcję starterów i są używane przez fragment Klenowa. Dostaniemy zatem kolekcję cząsteczek
komplementarnych do danej cząsteczki DNA. Będą
one znakowane radioaktywnie (otrzymamy sondy, które posłużą do przeszukania biblioteki).
Stabilna hybryda
A zatem musimy dysponować sondą, która jest dostatecznie stabilna.
• Hybryda DNA-RNA (rybosonda)
Otrzymujemy replikę gotową do właściwego procesu hybrydyzacji. Eksperyment hybrydyzacji polega na
tym, że w roztworze zamieszczamy ten filtr mikrocelulozowy z immobilizowanym DNA, a w roztworze znajduje się sonda znakowana radioaktywnie. Sonda wiąże
się z DNA: wiązania niespecyficzne są bardzo słabe,
zaś wiązania specyficzne bardzo mocne. Nadmiar sondy jest odmywany (sonda wiązana niespecyficznie jest
usuwana). Replika jest suszona, następnie przykładany
jest film rentgenowski, który pod wpływem promieniowania jonizującego ulega zaczernieniu (zaczernienie ukazuje sondy związane z DNA. Porówanie płytki
z koloniami {...}
Substratem do znakowania DNA jest dNTP. Taki
znacznik zawiera izotop fosforu (P32), który znajduje
się w pozycji α. (Do znakowania zaś końców 5’ stosowany jest ATP ze znakowaniem w pozycji γ i ta reszta
jest przenoszona przez kinazę T4 na 5’ koniec).
Hybryda DNA-RNA
DNA
RNA
Membrana
nitrocelulozowa/nylonowa
Bakterie przyczepione
do membrany
Bakterie
Zasada
+ proteaza
DNA
Niesparowane zasady
Sonda ze znakowanym DNA
* **
* * **
Przemycie
Film rentgenowski
* * **
... zobacz całą notatkę

Komentarze użytkowników (0)

Zaloguj się, aby dodać komentarz