To tylko jedna z 2 stron tej notatki. Zaloguj się aby zobaczyć ten dokument.
Zobacz
całą notatkę
Wymaga precyzji w planowaniu końców DNA w miejscu ich styku. Wybór miejsca restrykcyjnego podyktowany obecnością specyficznej dla danego genu translacyjnej ramki odczytu- ORF (Open Reading Frame0 każda sek DNA lub RNA, która może podlegać translacji). Fuzji translacyjnych dokonuje się z fragmentami DNA kodującymi domeny peptydowe znajdujące się w tej samej ramce co kodon ATG. Powstaje białko hybrydowe z dodatkowymi AA w części N-terminalnej (fuzja proksymalna).
Fuzje mogą być też dystalne tj z domeną C-końcową albo z domenami N i C-końcowymi flankującymi analizowane białko.
IG pozwala na tworzenie białek fuzyjnych (rodzaj świadomej korekty pierwotnej struktury genu, zapewniającej większą ekspresję).
Niekiedy kodony AA mogą tworzyć układy zaburzające prawidłową syntezę białka. Np. układ kodonów dla Arg- AGGAGG przypomina sekwencję Sch-D (AGGAGGACAGCUAUG) co może powodować wiązanie rybosomów w miejscach do tego nieuprawnionych i blokować właściwą translację.
Odp programy komputerowe pozwalają na optymalizację kodonów aminokwasowych, zależnie m.in. rodzaju komórek gospodarza czy miejsca docelowej lokalizacji genu (preferencje wobec genów cytoplazmatycznych (bogate w GC) i plastydowych (bogate w AT).
Typy fuzji genowych:
Transkrypcyjna:
---Promotor- RBS- Sekwencja kodująca---
Translacyjna prosta (wybór restryktaz mających w obszarze sekwencji docelowej ATG):
---Promotor- RBS- CATATG- Sekwencja kodująca- GAATTC---
NcoI EcoRI
Translacyjna złożona- dająca białko hybrydowe:
---Promotor- RBS- ATG'GCT'AAT'TGC'- GAATTC- Sekwencja kodująca- GAATTC---
Domena kodująca EcoRI EcoRI
Składanie elementów DNA:
Prawidłowa: ---Promotor SD- ATG- 123- 123- 123- 12 3-123-123-123---
Fragment wektora Gen
Prawidłowa:
---Promotor SD- ATG- 123- 123- 123- 1 23-123-123-123---
Nieprawidłowa:
---Promotor SD- ATG- 123- 123- 123- 12 23-123-123-123---
Nieprawidłowa:
---Promotor SD- ATG- 123- 123- 123- 1 123-123-123-123---
Nukleotydy flankujące i przyłączony gen (ostatni nukleotyd/ y wektora i początkowe wstawki) muszą tworzyć ORF z kodonem ATG (inicjatorowi). Miejsce łączenia nie może generować sygnałów STOP.
Białka fuzyjne (chimeryczne, hybrydowe):
Powstają z połączenie 2/ kilku genów pierwotnie od za produkcję zupełnie oddzielnych białek.
(…)
… wstawki) muszą tworzyć ORF z kodonem ATG (inicjatorowi). Miejsce łączenia nie może generować sygnałów STOP.
Białka fuzyjne (chimeryczne, hybrydowe):
Powstają z połączenie 2/ kilku genów pierwotnie od za produkcję zupełnie oddzielnych białek. Produktem genu fuzyjnego to białko/ peptyd, którego funkcja może być pochodną uncji białek kodowanych przez geny wchodzące w skład takiego połączenia.
W biotach…
... zobacz całą notatkę
Komentarze użytkowników (0)