Inżynieria genetyczna- wykład 11

Nasza ocena:

5
Pobrań: 497
Wyświetleń: 1638
Komentarze: 0
Notatek.pl

Pobierz ten dokument za darmo

Podgląd dokumentu
Inżynieria genetyczna- wykład 11 - strona 1 Inżynieria genetyczna- wykład 11 - strona 2 Inżynieria genetyczna- wykład 11 - strona 3

Fragment notatki:

11.05.2012
Inżynieria genetyczna – wykład 11
Techniki używane do analizy proteomu
Proteom – zbiór białek ulegających ekspresji, które są produktami genów aktywnych w danym
momencie w danej tkance/komórce.
Transkryptom i proteom bardzo silnie korelują ze sobą ale badane są one niezależnie, ponieważ nie
muszą być identyczne ze względu m.in. na alternatywne procesowanie transkryptu – repertuar białek
jest większy niż to co mamy na początku.
Metody używane do profilowania (inaczej badania) proteomu:

Połączenie elektroforezy dwuwymiarowej i spektrografii masowej - najczęściej używane,
jest to połączenie dwóch technik.
W pierwszym etapie eksperymentu próbka/ekstrakt komórkowy/ekstrakt tkanki jest poddawana
elektroforezie w dwóch wymiarach. Zasada rozdziału w pierwszym i drugim wymiarze jest różna – w
jednym wymiarze (kierunku) jest to rozdział w warunkach denaturujących, w drugim może być np.
izoelektroogniskowanie.
Istota rozdziału - elektroforeza jest prowadzona najpierw w jednym kierunku, otrzymujemy jakieś
produkty, które następnie są (po obróceniu żelu) chromatografowane w drugim kierunku.
Wybarwiamy żel i otrzymujemy obraz taki jak widać na obrazku wyżej na ostatnim chromatogramie –
plamy/punkty odpowiadające poszczególnym białkom.
Rozdzielczość tej techniki jest ogromna – możemy zobaczyć wybarwione punkty odpowiadające
danym białkom obecnym w danym momencie w komórce.
W tym etapie następuje rozdział, wydzielenie stałej mieszaniny tych białek, które chcemy następnie
poddać analizie.
Następnie mamy etap identyfikacji. Tak naprawdę dowolna technika pozwalająca nam na
powiedzenie jakiemu białku odpowiada punkt byłaby użyteczna. Obecnie techniką najbardziej
użyteczną, pozwalającą na identyfikację bardzo małej ilości białek jest technika spektrografii
masowej.
Jak jest to możliwe?
Otóż sam aparat który służy nam do podania masy a właściwie stosunku masy i ładunku białka który
jest analizowany w tej technice byłby niczym gdyby nie bazy danych, które pozwalają nam na
przypisanie wyniku otrzymanego na skutek spektrografii masowej określonej charakterystyce białka,
czyli określonej strukturze pierwszorzędowej.
Tak naprawdę najczęściej po wykonaniu elektroforezy dwuwymiarowej fragment żelu zawierający
białko jest izolowany, następnie zlokalizowane w nim białko jest poddawane trawieniu enzymami
proteolitycznymi, otrzymujemy krótkie fragmenty które są analizowane w spektrogramie masowym.
Każdy fragment o określonej strukturze I-rzędowej powinien mieć też charakterystyczny stosunek
ładunku do masy. W ten sposób identyfikowane są krótkie peptydy, które potem złożone w całość
mówią nam o tym jakie mieliśmy białko.
Przy pomocy tej techniki profiluje się białka dla wybranych stanów komórki np. stanu
nowotworowego, stanu odpowiadającego jakiejś chorobie lub innym stanom metabolicznym
powodującym powstanie takiego a nie innego proteomu.
Metody służące analizie proteomu ale pod innym kątem - nie jako całości, tylko jego wybranych
elementów. Ich celem jest badanie oddziaływań białko – białko. W pewnych wariantach metody te
mogą być użyteczne do badania całych zestawów białek.

Phage display
prezentacja białek na
fagach – istota/wyjście
do tej metody jest na
schemacie. Mamy faga o
budowie filamentowej z
osłonką białkową a tam
poszczególne
białka
widoczne na zewnątrz faga – gdybyśmy się zmniejszyli do wielkości faga to byśmy zobaczyli
to białko – nie genom w środku tylko osłonkę białkową.
Istota phage display - kontruuje się specjalne fagi, których osłonka składa się z białek, które w części
są właściwymi fagowi naturalnymi białkami, a w części zawierają dodatkowy element białkowy, który
jest prezentowany na fagu (stąd nazwa).
Schemat pokazujący jak jest skonstruowany genom faga – gen fagowy, który koduje białko
osłonkowe jest zmieniany
metodami
inżynierii
genetycznej tak że możemy
doklonować
do
niego
interesujący
nas
gen
naszego białka.
Różne białka fagowe są
wykorzystywane,
różne
geny w zależności od typu
faga, z reguły są to fagi filamentowe ale są różne szkoły/metody co do wykorzystania genów; zasada
jest taka sama – powstaje białko fuzyjne składające się z dwóch białek – fagowego osłonkowego i
analizowanego przez nas.
Po co to wszystko?
Załóżmy że nie klonujemy jednego genu, nie używamy jednej ramki odczytu tylko wklinowujemy
bibliotekę mutantów. Otrzymujemy
bibliotekę fagów które prezentują na
swojej powierzchni różne wersje
badanego białka. Wyobraźmy sobie,
że takim białkiem jest przeciwciało –
a
dokładniej
jego
fragment
odpowiedzialny
za
wiązanie
antygenu. Musimy skonstruować
przeciwciało
o
najwyższym
powinowactwie
do
zadanego
antygenu. To przeciwciało badamy w
postaci biblioteki przeciwciał, której składniki różnią się tym, że mamy różne wersje przeciwciała o
różnym powinowactwie (nie wiemy które ma najwyższe powinowactwo). Otrzymane przez nas fagi
muszą być użyte do eksperymentu przeszukania. Na schemacie mamy przekrój dołka w płytce
plastikowej, który jest opłaszczony białkiem które zawiera antygen – roztwór z białkiem zawierającym
antygen do przeciwciała jest wlewany do płytki, pozostawiany na jakiś czas a potem usuwany. Białka
na takich płytkach ulegają fizycznej adsorpcji – niekonwalencynymi oddziaływaniami ale na tyle
silnymi że białko pozostaje w dołku. Możemy mieć to w wielu dołkach na płytce (gdy badamy
jednocześnie wiele białek). Do dołka dodawana jest zawiesina w której znajduje się biblioteka fagów.
Spośród tej zawiesiny te fagi, które wykazują znaczące powinowactwo będą się wiązały z antygenem
przez przeciwciało połączone z białkiem osłonkowym a te, które się nie zwiążą pozostaną w
zawiesinie. Następnie roztwór z zawiesiną jest usuwany i w dołku na płytce pozostają związane fagi.
Taką procedurę powtarza się wielokrotnie. Na końcu otrzymujemy te fagi, których powinowactwo do
antygenu jest najwyższe.
Metoda jest bardzo popularna, bo pozwala na selekcję białek, jednoczesną pracę z bibliotekami
często bardzo złożonymi. Nie jest stosowana tylko do przeciwciał, można nią badać jakiekolwiek
oddziaływanie białko – białko lub nawet białko – DNA (wtedy płytka opłaszczona DNA).
Na końcu selekcji mamy silnie związane z antygenem fagi, a przecież szukamy przeciwciała. Fagi są
uwalniane z płytki, izoluje się ich DNA a następnie sekwencjonuje – mamy sekwencję która wklonuje
dane białko wyselekcjonowane poprzez prezentację na fagu.

Metoda drożdżowego systemu dwuhybrydowego - również pozwala na badanie
oddziaływań białek. Jej podstawową zaletą w odniesieniu do metody phage display jest to, że
w metodzie tej badamy oddziaływanie wewnątrz komórek.
Schemat aktywacji transkrypcji zależnej
od receptora jądrowego 
Receptor jądrowy składa
następujących domen:



się
z
Domena wiążąca DNA (DBD) –
występuje
w
większości
czynników transkrypcji, wiąże
specyficzną sekwencję
Domena wiążąca ligand (LBD) czujnik, który
wychwytuje
specyficzny
dla
receptora
ligand, prowadzi z reguły do
aktywacji całego receptora, który potem wiążąc się przez DBD z odpowiednim elementem
regulatorowym genu aktywuje transkrypcję czyli powstaje produkt danego genu.
Domena aktywatorowa (AD)
Hormon wnika do komórki, gdzie wiąże się z domeną ligandowi receptora. To z reguły powoduje
zmianę konformacyjną domeny ligandowej, uwolnienie białek hamujących funkcję receptora, i tak
zaktywowany receptor (tu na przykładzie glukokoltykoidowego) wnika do jądra komórki gdzie wiąże
element regulatorowy DNA – został związany na promotorze aktywującym jakiś gen. Te receptory z
reguły dimeryzują w jądrze (jak na schemacie). Dla tej lokalizacji kluczowa jest domena wiążąca DNA.
Aktywacja też jest istotna, ale ona nie w każdym czynniku transkrypcyjnym jest zależna od ligandu.
Druga domena kluczowa do aktywacji transkrypcji to jest AD – ona kontaktuje się z podstawowym
aparatem transkrypcyjnym co powoduje zmiany poziomu transkrypcji.
Najważniejsze dla nas z tego schematu jest to, że domena wiążąca DNA i domena aktywatorowa
muszą znaleźć się w mniej więcej tym samym miejscu na promotorze genu którego transkrypcja ma
być aktywowana.
Istotą systemu dwuhybrydowego jest to, że korzysta się w dwóch rodzajów konstruktów, których
produktami są dwa rodzaje białek hybrydowych:
 Przynęta/wędka - składa się z
dwóch części – domeny wiążącej DNA i
białka, którego oddziaływanie z innym
partnerem chcemy badać (A).
 Składa
się
z
domeny
aktywatorowej i białka, które z tą
przynętą/wędką potencjalnie może
oddziaływać (B).
 Jeżeli białka A i B tworzą kompleks, to
powodują że DBD i AD są zlokalizowane
blisko siebie. W naszym teście transkrypcja
genu reporterowego jest uwarunkowana
oddziaływaniem białek A i B. Jeżeli
oddziaływanie
ma
miejsce,
zostaje
aktywowana
transkrypcja.
Gdyby
oddziaływania nie było, to DBD by się
związało do elementu promotorowego, ale
brakuje AD i transkrypcja nie zachodzi.
Ten rysunek tłumaczy nam czym są konstrukty używane do tworzenia systemu dwuhybrydowego.
Mamy dwa wektory które służą do ekspresji tych dwóch białek hybrydowych. To są wektory
przygotowane do użycia w komórkach drożdżowych i bakteryjnych.
Wektor z lewej:





domena wiążącą DNA, to jest domena z drożdżowego czynnika transkrypcji GAL4.
białko „przynęta”. Ekspresja tego konstruktu daje nam białko chimeryczne składające się z
dwóch części – domeny wiążącej DNA i części będącej „przynętą”.
2μ ori – ori charakterystyczne dla wektorów
drożdżowych
CamR – gen kodujący odporność na
działanie kanamycyny (antybiotyku) – bo
wektor też jest używany do propagowania
DNA w komórce prokariotycznej
TRP 1+ gen markerowy dla komórek
drożdżowych
Wektor z prawej:





Domena aktywacyjna GAL4
Drugie białko którego oddziaływanie
badamy, jego gen jest wklinowywany
2μ ori
ampR – gen oporności na działanie ampicyliny
LEU 2+ gen potrzebny do selekcji w komórkach drożdżowych
Jeżeli produkty powstają to mamy oddziaływanie z elementem regulatorowym GAL4 i pod kontrolą
tego promotora zawierającego ten element regulatorowy GAL4 jest gen LacZ czyli jeżeli dochodzi do
oddziaływania pomiędzy dwoma białkami chimerycznymi to jest aktywowany gen LacZ, pojawiają się
te kolonie, w których doszło do oddziaływania (od razu są widoczne na pożywce jako kolonie
niebieskie)
W tym układzie zawarte są także inne selekcje - oba wektory posiadają geny TRP 1+ i LEU 2 +. To są
geny kodujące białka potrzebne do biosyntezy z jednej strony tryptofanu, z drugiej strony leucyny. W
eksperymencie używa się komórek drożdżowych które mają uszkodzone te geny (dokładnie te które
są w wektorach). Uszkodzenie tych genów powoduje że komórki drożdżowe są zależne od
aminokwasów dostarczonych z zewnątrz. Jeżeli wysiejemy te bakterie na podłoże pozbawione
leucyny i tryptofanu to na tym podłożu przeżywają tylko te komórki, które ulegają transformacji tymi
oba wektorami. Dzięki temu mamy dodatkową selekcję tylko tych transformowanych klonów.
Gdybyśmy do wektora z lewej wklonowali gen białka A, natomiast do wektora z prawej cDNA z
biblioteki. Wtedy badamy, z jakimi białkami białko A może oddziaływać z całego proteomu. Jeżeli
otrzymamy bibliotekę cDNA która odpowiada transkryptomowi jakiejś komórki to możemy teraz taki
cDNA (są oczywiście różne ramki odczytu reprezentowane w takim cDNA), który jest teraz
reprezentantem wszystkich możliwych białek, użyć do ligacji z drugim wektorem. Wtedy otrzymamy
bibliotekę, w której będą testowane wszelkie możliwe oddziaływania białka A z wieloma innymi
partnerami jednocześnie.
Oczywiście często oddziaływanie między białkiem X i Y czy A i B wymaga udziału trzeciego i takich
oddziaływań tutaj nie zaobserwujemy. Oddziaływanie A i B które nie wymaga oddziaływania
trzeciego partnera może być testowane w takim układzie.
Są też przeprowadzane inne wersje testu dwuhybrydowego, np. test dwuhybrydowy w komórkach
ssaczych (oczywiście inne wektory są wtedy używane) czy w komórkach owadzich, bakteryjnych ale
początek był stworzony dla komórek drożdżowych.
Produkcja białek
Kiedy już gen jest sklonowany, to bardzo często z powodów dla których otrzymujemy w ogóle gen lub
cDNA jest to, że chcemy otrzymać białko w formie rekombinowanej. Powodów dla których te białka
są otrzymywane są dziesiątki. To może być powód natury poznawczej, np. chcemy (kiedy są
prowadzone badania podstawowe zupełnie) opisać białko a te ciekawe białka zazwyczaj występują w
bardzo małych ilościach w komórce i ich charakterystyka molekularna i biochemiczna nie byłby
możliwa bez produkcji takiego białka w układzie poza komórką w której białko normalnie istnieje.
Mogą być powody inne jak np. otrzymanie leków (białka są też lekami, duże polipeptydy). Można po
prostu prowadzić produkcję białka z genów.
Produkcja tych polipeptydów sięga początków ubiegłego wieku, kiedy pierwsze eksperymenty w
których wykorzystywano mikroorganizmy do produkcji różnego rodzaju związków użytecznych były
prowadzone, np. eksperymenty prowadzące do otrzymania penicyliny i innych związków, też
makrocząsteczkowych. Pierwsze eksperymenty były wykonywane w ten sposób, iż korzystano z tego
co jest w naturze, a więc z mikroorganizmów i tego co mogą wytworzyć. Metody inżynierii
genetycznej spowodowały rewolucję w produkcji użytecznych produktów w warunkach używanych
do korzystania z mikroorganizmów, do produkcji i biotransformacji. Metody inżynierii genetycznej
spowodowały że możemy w sposób celowy projektować eksperyment który zmierza do otrzymania
jakiegoś rekombinowanego białka. Konceptualnie te procesy nie są trudne. Ale praktyka pokazuje że
nie jest to takie proste jak nam się wydaje. Dlatego że, nawet jeżeli wszystkie problemy, które są
znane w praktyce często się ludzie z nimi spotykają, jeśli te problemy będą rozwiązywane to nie ma
pewności, że produkt białkowy otrzymamy jako aktywne białko, dlatego że jest to bardzo złożony
proces - biosynteza białka - o czym literatura donosi.
 Mamy tu schematycznie pokazane
na schemacie jak wygląda
eksperyment, w którym
przeprowadza się produkcję białka
zwierzęcego w komórce bakteryjnej.
Najczęściej w tym celu korzysta się z
komórek bakteryjnych do produkcji
białek rekombinowanych. Dzieje się
tak, bo jest to bardzo prosty układ
niepozbawiony wad, jak zobaczymy,
ale układ który jeżeli ma się szczęście
daje w prosty sposób i z dużą
wydajnością rekombinowane białko.
Eksperyment przeprowadza się w ten
sposób, iż mamy na początku
komórkę, oczywiście komórkę
eukariotyczną, z której izolowany jest
gen; w jakiś sposób jest zatem
wydzielana informacja genetyczna i
ten gen jest wklinowywany do
wektora. Oczywiście są szczegóły, o
których będziemy mówili; jak ten gen
jest przygotowywany właśnie i
następnie wektor, o którym mówimy, że jest to wektor ekspresyjny jest przenoszony do komórki
bakteryjnej na drodze transformacji; zachodzi transkrypcja i jest syntezowane białko. Teraz
przejdziemy do szczegółów.
Wektory do ekspresji obcych genów w E. Coli
Gdybyśmy wzięli gen eukariotyczny tak jak on jest i umieścili go w komórce prokariotycznej, to szansa
na to, że ten gen ulegnie ekspresji, czyli da transkrypt a potem białko jest praktycznie równa 0.
Dlatego, że geny eukariotyczne posiadają sekwencje funkcjonalne, które funkcjonują w komórce
eukariotycznej, natomiast w komórce prokariotycznej byłyby kompletnie nieaktywne. Są to
sekwencje które są opisane na schemacie, który państwo widzicie. Pierwszą z tych sekwencji, taką
kluczową dla ekspresji genu jest sekwencja promotorowa; czyli ta która startuje, jest sekwencją od
której transkrypcja się rozpoczyna, na skutek oddziaływania polimerazy RNA z naszą sekwencją
promotorową. Sekwencje promotorowe w komórkach eukariotycznych i prokariotycznych różnią się
w sposób dramatyczny i chociażby z tego powodu transkrypcja nie byłaby inicjowana. Następnym
elementem, który jest ważny dla rozumienie różnic między genami, różnic które powodują że musimy
dokonać manipulacji aby transkrypcja zaszła jest sekwencja terminatorowa; określa miejsca w którym
transkrypcja
jest
kończona.
Pamiętamy,
że
w
genach
prokariotycznych jest to taka
sekwencja, która koduje spinkę do
włosów w transkrypcie i jest to
sygnał do zakończenia procesu
transkrypcji. No i wreszcie 3 taki
krytyczny punkt, który musimy brać
pod uwagę to jest miejsce wiązania
rybosomu. Jest to krótka sekwencja,
która jest rozpoznawana na
transkrypcie, ale ona przecież jest
zapisana w genie, gdzie wiąże się rybosom i gdzie rozpoczyna się translacja.
Czyli mamy już 3 sekwencje, które muszą być brane pod uwagę jeżeli chcemy gen eukariotyczny
ekspresjonować w komórce prokariotycznej. I teraz jak ten problem jest rozwiązywany, problem
różnic w sekwencjach promotorowych. W wektorze są po prostu określone sekwencje
wbudowywane, które są sekwencjami charakterystycznymi dla komórki prokariotycznej. Czyli
sekwencja kodująca dostarczana jest z komórki eukariotycznej, natomiast elementy ochronne takie
jak promotor, SBS, sekwencja terminatorowa one pochodzą właśnie z typowych genów
prokariotycznych. Najbardziej krytyczny jest promotor, dlatego że sekwencja promotorowa która jest
w wektorze ekspresyjnym jest niczym innym, jak sekwencją która inicjuje cały proces ekspresji
genów. P drugie sekwencja promotora jest tą sekwencją, która decyduje o efektywności transkrypcji i
jest to niejako ten pierwotny poziom który określa to, ile dostaniemy produktu białkowego.
Naturalną tendencją eksperymentatora jest maksymalizacja wydajności; chcemy otrzymać jak
najwięcej produktu białkowego rekombinowanego, co nie zawsze jest słuszne. Są takie bowiem
białka, które są toksyczne dla komórki bakteryjnej. Wtedy należy myśleć o promotorze, który daje
nam mało produktu. Także wiedza o promotorze, kiedy planuje się eksperyment ekspresji często jest
bardzo ważna i trzeba zdawać sobie z tego sprawę jaki promotor występuje w danym konstrukcie.
Wróćmy do schematu, który już
pokazywałem Państwu. Pokazana
jest na nim różnica w promotorach
prokariotycznych i eukariotycznych.
Oba

pokazane
jako
konsensusowi
sekwencje;
uzgodnione i dla E.coli są istotne
sekwencje -35 i -10. Sekwencje
promotorów bakteryjnych E.coli,
które występują w rzeczywistości
oczywiście różnią się między sobą;
różnią się szczegółami jeżeli chodzi o -35 kasetę i -10 i to oczywiście prowadzi do różnic w ekspresji.
Czyli występują silne i słabe promotory. Silny promotor charakteryzuje się tym, że transkrypcja na
takim promotorze jest po prostu często inicjowana. Kluczem jest częstości inicjacji transkrypcji. A
więc silny promotor to taki, który wiąże silnie polimerazę RNA i może ona efektywnie inicjować
transkrypcję. Jeżeli oddziaływanie między promotorem a polimerazą jest słabe, to polimeraza może
się
związać
i
następnie
oddysocjować zanim rozpocznie
transkrypcję. W sytuacji dla
silnego promotora, powstaje dużo
transkryptu i dostajemy dużo
produktu białkowego. Z kolei
jeżeli mamy słaby promotor to ta
skuteczność inicjacji transkrypcji
jest słaba. Wtedy dostajemy
względnie mało transkryptu, które
oczywiście przekładają się na ilość
produktu białkowego. Jakie zatem
promotory są wybierane? Silne
czy słabe? Oczywiście najczęściej
wybierane są silne, chociaż są też
wektory, ale są one wyjątkami,
które są promotorami słabymi.
Drugą cechą jaką musi wykazywać promotor, który jest wykorzystywany do ekspresji białka jest to
aby mógł być on regulowany. To znaczy, aby było możliwym włączenie i wyłączenie aktywności tego
promotora; żeby aktywność promotora mogła być kontrolowana przez eksperymentatora. Otóż jest
to ważne z tego powodu, często mamy do czynienia z produktami białkowymi które są toksyczne i
gdyby promotor nie podlegał regulacji, czyli byłby aktywny cały czas od momentu transformacji
komórki bakteryjnej, to po prostu komórka umarłaby zanim otrzymalibyśmy pożądaną ilość produktu
białkowego. Chociażby z tego powodu dążymy do tego, aby w wektorach ekspresyjnych promotor był
regulowany. Po drugie zauważono, ze najwyższą wydajność zwykle otrzymuje się, gdy hodowla jest
już dostatecznie gęsta. Ta gęstość podobnie określana jako OD600 jest różna dla różnych typów
komórek, ale jest taka optymalna gęstość hodowli, przy której ekspresja danego produktu
białkowego zachodzi z najwyższą wydajnością. To znaczy też, że w tym momencie, po osiągnięciu tej
gęstości, promotor powinien być zaktywowany.
Pierwszy
przykład
regulowania
promotora dotyczy genu, którego
transkrypcja może być indukowana.
Widzimy gen i jego promotor i w
stanie, które jest tu określony jako
standardowy, ten gen jest wyłączony;
nie ma transkrypcji. Jeżeli ten
promotor jest w genie, który mówimy
że jest indukowany, to pod wpływem
jakiegoś
związku
chemicznego
dochodzi do aktywacji promotora i gen jest włączany; uruchamiana jest transkrypcja. Jeżeli byśmy
taki promotor użyli do ekspresji to możemy po prostu wpływać na transkrypcję ; na rozpoczęcie
transkrypcji poprzez dodanie tego związku. To jest bardzo prosty układ. To co widzimy tutaj, to jest
operon laktozowy.
A to jest drugi sposób regulacji w
układzie w którym mamy gen który
ulega ekspresji, którego transkrypcja
ulega zahamowaniu. Jest to niejako
odwrócenie sytuacji poprzedniej.
Widzą państwo promotor, który
kontroluje ekspresję genu i w
układzie tym, w którym gen ulega
ekspresji, a związek chemiczny który
się pojawia po prostu hamuje transkrypcję poprzez promotor. Taki układ
wykorzystywany do ekspresji białek; do kontroli regulacji ekspresji.
też czasami bywa
No i teraz przykłady promotorów, które pojawiają się w wektorach ekspresyjnych. Będzie ich 5.
Pierwszym z promotorów, który jest bardzo
często wykorzystywany jest promotor lac. No i
to już państwo wiecie co to jest; pochodzi z
operonu laktozowego. Bezpośrednio znajduje
się przed genem lacZ. Kontrola zachodzi
poprzez
indukcję
jakimś
związkiem
chemicznym. W naturalnych warunkach, kiedy mamy do czynienia z E.coli tym związkiem jest laktoza,
która ulega przekształceniu do allolaktozy. Natomiast w eksperymentach nadekspresji białek
związkiem, który jest z reguły wykorzystywany do aktywacji promotora poprzez dodanie go do
pożywki IPTG. IPTG to jest izopropylotiogalaktozyd. Jest on zatem używany jako typowy aktywator
promotora lac.
Drugim przykładem promotora,
który jest bardzo często używany
też jest promotor pochodzący z
operonu
tryptofanowego.
Możemy korzystając z tego
promotora przeprowadzać parę
rodzajów operacji; aktywację
transkrypcji genu pod kontrolą tego promotora, a z drugiej strony hamować ją. Ten promotor jest
hamowany w obecności tryptofanu; jest on korepresorem. Jest takie białko represorowe, które w
kontakcie z tryptofanem hamuje transkrypcję tego operonu tryptofanowego. Ale jest taki związek 3beta-indoliloakrylowy kwas, który aktywuje transkrypcje tego promotora. Także można też po
odczekaniu, czy też w dowolnym momencie aktywować transkrypcję przez ten związek.
Kolejnym przykładem promotora który
jest bardzo często wykorzystywany jest
promotor tac. Ten promotor jest już
promotorem
który
jest
niejako
wytworem
inżynierii
genetycznej.
Promotor, który nie istnieje w
przyrodzie i który jest hybrydą
pomiędzy promotorem trp i lac. Stąd taka nazwa. On ma taką zaletę że może być łatwo indukowany
przez IPTG. Ale zaletą jego jest też to, że jest silniejszy do promotora lac i trp. Czyli dostajemy więcej
transkryptu i więcej produktu z tego promotora i on może być przez IPTG.
Czwartym przykładem jest promotor,
który pochodzi z faga lambda.
Promotor λPL, który jest jednym z
promotorów obecnych w fagu lambda
i jego zaletą jest to, że ten promotor
jest bardzo silnym promotorem. On
jest też wykorzystywany przez
polimerazę bakteryjną, czyli z tego promotora może prowadzić transkrypcję polimeraza bakteryjna;
nie jest nam potrzebna żadna zewnętrzna polimeraza. To jest zaleta oczywiście, ale również wada,
dlatego że jeśli polimeraza miałaby dostępny ten promotor cały czas, to transkrypcja biegłaby od razu
po transformacji komórek bakteryjnych tym promotorem. Oczywiście skutki mogą być fatalne o czym
mówiłem wcześniej. Czyli ten promotor musi być kontrolowany w jakiś sposób. Otóż promotor λ-PL
jest promotorem, który może być kontrolowany przez λ-represor. Represor ten jest produktem genu
C1, to jest gen który jest genem fagowym. Są takie 3 geny faga lambda, represor lambda jest
kodowany przez gen C1. Do kontroli promotora tego używany jest zatem λ-represor, który oczywiście
musi być dostarczony do komórki z genu, który w odpowiednim wektorze jest wprowadzany do
komórki. Ten λ -represor ma właściwości biochemiczne inne niż λ -represor typu dzikiego. Poniżej 30
stopni nie mamy transkrypcji, powyżej 30( powiedzmy 37) transkrypcja jest obserwowana i kluczem
jest właśnie ten represor o zmienionych właściwościach. Korzystając z metod inżynierii genetycznej
wybrano taki wariant λ-represora, którego struktura jest niestabilna i wrażliwa na temperaturę. Dla
wielu białek takie warianty zostały znalezione. Poniżej 30 stopni λ-represor jest aktywny, ponieważ
jego struktura 3-rzedowa w tej temperaturze jest zachowana, jeżeli temperatura wzrasta to ulega on
destabilizacji; traci swoją aktywność i nie wiąże się z sekwencja kontrolująca λ-promotora i ten
promotor może być aktywny transkrypcyjnie dlatego że λ represor oddysocjowuje. Jest to przykład
kontroli w której nie korzystamy z żadnych związków chemicznych, tylko zmieniamy po prostu
temperaturę.
Jeszcze jeden przykład promotora. To jest przykład promotora, który jest rozpoznawany przez
polimerazę T7. Pochodzi on z faga T7.
Zaletą tego promotora jest to iż jest
on obcy. Tzn. nie jest on typowy dla
komórki bakteryjnej, bo jest przecież
promotorem fagowym. To znaczy ze
polimeraza RNA komórki bakteryjnej
tego promotora nie rozpoznaje. Jeżeli
tylko w komórce bakteryjnej nie ma polimerazy faga T7 to transkrypcja jest wyłączona. Może ja
wrócę do promotora lac. Na schemacie wyglądało to wszystko pięknie, to znaczy nie mamy IPTG brak
transkrypcji, dodanie IPTG powoduje rozpoczęcie transkrypcji. Prawda jest taka, że w tych
promotorach, w których transkrypcja prowadzona jest przez bakteryjną polimerazę mamy często do
czynienia z czymś co nazywamy nieszczelnością albo cieknięciem promotora. Sprowadza się to do
tego, że pomimo braku aktywacji promotora, podstawowy poziom transkrypcji ma miejsce i
pojawiają się produkty białkowe bez aktywacji, czyli zaraz po transformacji komórek bakteryjnych.
Często właśnie kiedy białko jest toksyczne, albo niekorzystne z jakiegoś względu dla komórki
bakteryjnej, to ta ekspresja obniża całkowitą wydajność procesu ekspresji białka w komórce
bakteryjnej. Zatem poszukiwano takich systemów ekspresyjnych, które byłyby całkowicie
kontrolowane; takie które możnaby było opisać systemem zero-jedynkowym. Naprzeciw takim
wymaganiom wychodzi system, w którym korzystamy z promotora T7. Ten system nie jest całkowicie
opisany na tym schemacie. Istotą jego jest to, ze jest to promotor T7, pod jego kontrolą
ekspresjonowany jest gen. Ten promotor jest zależny zatem od polimerazy T7. Polimerazę tą bierze
się ze specjalnego szczepu bakteryjnego, w którym w chromosomie bakteryjnym jest wbudowany
gen kodujący polimerazę T7. I kontrola ekspresji tego genu jest kontrolowana przez promotor, który
jest zależny od IPTG. Tu macie państwo na schemacie kontrolę przez IPTG ekspresji polimerazy T7 i
polimeraza T7 wyindukowana w odpowiednim momencie powoduje transkrypcje genu w wektorze
którego gen jest umieszczony jest pod kontrola T7 promotora. Można przypuszczać, że tu nie ma
żadnej zalety, bo też tu mamy układ zależny od IPTG, czyli ekspresja T7 zależy od polimerazy
bakteryjnej. Są jeszcze dodatkowe zabezpieczenia tego układu. Praktyka jest taka, że systemy w
których wykorzystuje się T7 są o wiele lepsze, niż te które opierają się na promotorach lac i jego
pochodnych.
Proszę Państwa, zatem
poznaliśmy większość
typowych (coś tam) które
używane są w wektorach
ekspresyjnych. Oprócz
promotorów wektor zawiera
inne elementy, o których już
wspominałem,
charakterystyczne dla
komórki prokariotycznej, dla
genów prokariotycznych i
mamy je w taki bardzo
schematyczny sposób tutaj
przedstawione. A więc
promotor, miejsce wiązania
rybosomów, oznaczone jako
R, P to promotor i T to
miejsce germinacji
transkrypcji. I one są
dostarczane w wektorze te
sekwencje. Czyli do wektora
wklonowywana jest tylko
sekwencja kodująca białko,
tu jest białko eukariotyczne.
Zatem wektor zawiera
odpowiednie miejsce
restrykcyjne, do którego
wprowadzana jest sekwencja
kodująca, która na tym
schemacie określona jest jako kaseta. Proszę nie mylić tego z mutagenezą kasetową. Czyli to było
schematycznie bardzo jak wyglądają realne wektory, cześć osób zna choćby wektor pGEX-2T .
Bardzo często wektor którego
używamy do ekspresji białka
eukariotycznego w komórce
prokariotycznej jest w ten sposób
przygotowany, skonstruowany, iż
miejsce restrykcyjne do którego
wbudowujemy sekwencję kodującą
białka, które ma być ekspres
jonowane, miejsce restrykcyjne,
zlokalizowane jest na końcu sekwencji
kodującej bądź białko bądź polipeptyd,
który jest białkiem bądź polipeptydem
ekspresjonowanym standardowo w
komórce bakteryjnej, to może być po
prostu białko lub polipeptyd który
pochodzi z E. coli bądź z innej bakterii.
Po co ta sekwencja bakteryjna
dołożona niejako do sekwencji
eukariotycznej? Otóż są cztery powody
dla których taka sekwencja jest
dokładana jako dodatkowa. Pierwszym
powodem dobudowania takiej sekwencji jest, iż w ten sposób początkowy fragment tran skryptu
który później powstaje jest tran skryptem typowym dla komórki prokariotycznej. Czemu jest to takie
ważne? Otóż to tłumaczy schemat. 
Dla niektórych tran skryptów
eukariotycznych bowiem okazało się,
że po ich zsyntezowaniu w komórce
prokariotycznej powstają struktury
wyższego rzędu, które są
schematycznie zaznaczone, struktury,
które powodują to, ze niedostępne
jest miejsce wiązania rybosomy co oczywiście powoduje brak transkrypcji. Natomiast jeśli użyjemy
jako tej starterowej sekwencji, która na początku transkrypcji się pojawia, sekwencji, która pochodzi z
genu E. coli wtedy dysponujemy układem w którym wiemy z góry że tego typu wiązania nie będą
obserwowane gdyż wiadomo że użyty przez nas fragment ulega zarówno efektywnej transkrypcji jak i
translacji. To jest pierwszy powód, a więc zapobieganie niekorzystnym strukturom mRNA
powstającym w wyniku transkrypcji. Drugi powód dla którego łączymy białko eukariotyczne z
fragmentem lub białkiem prokariotycznym, czyli tak naprawdę syntezujemy białko hybrydowe, czy
tez fuzyjne jest powód innego rodzaju. Dotyczy on już nie tran skryptu a produktu białkowego. Otóż
stabilność białek zarówno w komórkach eukariotycznych czy też prokariotycznych zależy bardzo
często właśnie od sekwencji N-terminalnej, czyli tej która jest syntezowana na samym początku. I
właśnie w układzie który teraz omawiamy mamy zadbane o to aby sekwencja N-terminalna kodowała
białko prokariotycznej co do którego mamy już dane eksperymentalne ze jest ono dobrze znoszone
przez komórkę, jest stabilne, czyli nie podlega degradacji. Natomiast w przypadku białek obcych,
nazwijmy je tak, często ze względu na inną niż prokariotyczna sekwencję N-terminalną dochodziło do
degradacji. Natomiast zaopatrzenie białka w sekwencje prokariotyczną, powoduje stabilizację, a
degradacja jest, bądź to zlikwidowana bądź zmniejszona. Często jest też tak że w tym fragmencie
bakteryjnym jest zawarta informacja o peptydzie sygnałowym. Jest to taki peptyd który kieruje białko
do określonej części komórki, w tym również komórki bakteryjnej. Te peptydy sygnałowe mogą być
różne. Pierwszy rodzaj o którym warto wspomnieć to peptydy sygnałowe które kierują białko poza
komórkę, czyli białko jest eksportowane na zewnątrz komórki bakteryjnej do pożywki. Czasem
stosuje się sposób białka bakteryjnego prowadząc do eksportu poza komórkę. To jest bardzo ważne
dla białek które się słabo fałdują, które we wnętrzu komórki ulegają redukcji. Wtedy można
eksportować białko poza komórkę korzystając z sekwencji sygnałowej. Drugim rodzajem peptydów
sygnałowych, które mogą być w tej sekwencji wbudowywane, są peptydy, które kierują białko do
przestrzeni peryplazmatycznej. W komórce E. coli istnieje cos takiego jak peryplazma, pomiędzy
zewnętrzną błoną komórkowa i wewnętrzną. Część białek które są trudno syntezowane i fałdowane
po ekspresji są eksportowane do peryplazmy i tam prawidłowo fałdowane i stają się aktywnymi.
Także często właśnie takie peptydy kierujące do peryplazmy są tutaj używane. wreszcie mamy
kolejny powód dlaczego element bakteryjne są dokładane do badanego białka. Kolejnym powodem
jest to że fragment bakteryjny, oprócz tych wszystkich zalet, które omawialiśmy, może być używany
do chromatografii powinowactwa produktu białkowego który jest ekspresjonowany. Jakiego rodzaju
mogą to być chromatografie powinowactwa? Różnego. O dwóch powiem teraz.
Pierwszym rodzajem
chromatografii jest
chromatografia
powinowactwa w której
wykorzystuje się N-terminalny
fragment białka hybrydowego
w którym jest s-transferaza
glutationu (GST) lub inaczej
glutationo s-transferaza.
Glutationo s-transferaza ma
wszelkie zalety które wcześniej
omawiałem, tzn. ulega
poprawnemu fałdowaniu w
komórce, nie tworzą się w
transkrypcie struktury
wyższego rzędu, białko nie
ulega degradacji itd., a
dodatkowo jeszcze fragment
glutationo s-transfrerazy
pozwala na przeprowadzenie
chromatografii
powinowactwa, gdyż glutationo s-transferaza wiąże się, jak sama nazwa wskazuje, z glutationem,
czyli z substratem. Kolumna do chromatografii powinowactwa zawiera im mobilizowany glutation.
Jeśli naniesiemy na kolumnę z immobilizowanym glutationem ekstrakt komórek bakteryjnych w
których jest produkowane białko fuzji z glutationo s-transferazą to oczywiście specyficznie ulegnie
związaniu białko hybrydowe zawierające fragment GST. Z immobilizowanym glutationem oddziałuje
fragment GST. Dzięki specyficznemu oddziaływaniu glutationu z GST z setek białek wyławiamy tylko
te które są istotne. Białka nieistotne, czyli niewiążące się z glutationem są wymywane, a na końcu,
przy pomocy glutationy jest eluowany hybrydowy produkt białkowy który otrzymujemy, jeśli nie w
czystej to bardzo podczyszczonej formie co byłoby praktycznie niemożliwe bez stosowania tego
znacznika w postaci GST.
Mamy tutaj pokazany schemat wektora pGEX. Jest to wektor do nadekspresji w komórkach
bakteryjnych. Mamy gen oporności na działanie antybiotyków, mamy (coś tam) pBR322, mamy
oczywiście fragment kodujący GST, jest on pod kontrolą promotora Ptac i tu mamy w powiększeniu
miejsce w którym prowadzimy wklonowanie, widać odpowiednie miejsca restrykcyjne, które można
wykorzystać, od BamH1 do NoD1. Wklonowuje się zawsze sekwencję o odpowiedniej ramce odczytu,
tak aby zachować ramkę odczytu z glutationo s-transferazą, która jest wcześniej w sekwencji. W
wektorze jest tez gen kodujący Lac rep resor. On jest wnoszony do układu aby kontrolować ekspresję
wektora pGEX. Oprócz tego jest tu zaznaczona sekwencja rozpoznawana przez proteazę. Do wielu
zastosowań białka hybrydowe, fuzyjne można zastosować tak jak powstają. W tym przypadku białko
ekspresjonowane z wektora pGEX byłoby z GST i potem moglibyśmy je używać. W niektórych
zastosowaniach nie ma znaczenia czy występuje ten znacznik N-terminalny czy nie. Ale w niektórych
zastosowaniach obecność tego bakteryjnego fragmentu jest zbyteczna lub niepożądana. Można ten
fragment usunąć, odtrawić przy pomocy proteazy. Te proteazy mogą być różne. Może być to
trombina, czynnik X, może być taka jak ta czyli (coś In inglisz) pro tease czyli proteaza która też jest
otrzymana metodami inżynierii genetycznej w której miejsce rozpoznawane nie jest rozpoznawane
przez żadną inną proteazę. W ten sposób otrzymujemy bardzo wysoką precyzje odtrawienia, gdyż
użycie proteaz jak m.in. trombina prowadziłoby do strawienia części na której nam zależy. Przed laty
prowadzono eksperymenty w których badano oddziaływanie domen wiążących DNA ECR i USP z
sekwencją HSP27 (ASP27?). Oba białka otrzymano w formie zrekombinowanej. Kiedy zaczynaliśmy
ten projekt otrzymaliśmy dwa rodzaje cząsteczek. Jedne były otrzymane w fuzji z GST a drugie bez
GST. Zaczęliśmy bada c oddziaływanie jednych i drugich z DNA. Ku naszemu zaskoczeniu te w fuzji z
GST dawały wyniki które były w ogóle nieinterpretowane. W ogóle nie mogliśmy zrozumieć tych
wyników eksperymentu. Obserwowaliśmy formy przy ogromnej masie i to było olbrzymim
zaskoczeniem. Musieliśmy bardzo dokładnie zastanowić się co takiego się dzieje i pokazaliśmy że GST
jest białkiem zdolnym do dimeryzacji po izomeryzacji. Nie było to wtedy oczywiste. Danych
literaturowych było bardzo mało. Kiedy zdaliśmy sobie sprawę że GST jest tym, fragmentem który
posiada aktywność której nie spodziewaliśmy się w naszych eksperymentach usunęliśmy ten
fragment poprzez odtrawienie trombiną i otrzymywaliśmy domeny pozbawione GST które
powodowały że wyniki eksperymentów mogliśmy w ogóle interpretować. I potem autorka
eksperymentu opublikowała na ten temat prace w której były dwa tytuły. Jeden tytuł, górna część,
dotyczyła ECR i USP, a dugi, podtytuł niejako, dotyczył tego że GST indukuje dimeryzację która może
szkodzić eksperymentom, na przykład w badaniach oddziaływania z DNA. Praca ta jest często
cytowana z powodu tej obserwacji funkcji GST często przemilczanej przez firmę która sprzedawała te
wektory.
Przy tek okazji warto jest jeszcze omówić inną klasę wektorów do ekspresji genów eukariotycznych w
których co prawda nie wykorzystuje się fragmentu prokariotycznego, ale które są zaopatrywane w
metkę, znacznik, powszechnie stosowany do chromatografii powinowactwa. Jest taki fragment który
koduje peptyd składający się z co najmniej sześciu reszt histydynowych i o takich wektorach też
koniecznie musicie Państwo wiedzieć ze istnieją takie wektory ponieważ są one powszechnie
używanie do nadekspresji białek.
Na podstawie wektora pQE-30, 31 i
32 możemy sobie przeanalizować jak
taki wektor jest skonstruowany i do
czego on służy. 30, 31 i 32 różnią się
tylko ramką odczytu, czyli w obszarze
wielokrotnego klonowania mamy
przesuniętą ramkę odczytu i
możemy każdej dowolnej z trzech
ramek odczytu wklinowywać
fragment. Jest tu duże ułatwienie
pracy. Jest gen oporności
antybiotyku, sekwencja inicjacji
transkrypcji Ori i potem mamy tę
część która jest konieczna do
klonowania. Mamy tam promotor,
jeszcze kolejny promotor PT5 który
jest pod kontrolą operatora ramek. Mamy powtórzoną jednostkę operatora Lac po to aby kontrola
byłas ścisła. Zauważmy ze w tym operonie, w tej wersji nie ma genu lac represora więc jeśli się
pracowało z tym wektorem trzeba było dysponować jeszcze jednym wektorem posiadającym lac rep
resor. Kolejne wersje wektora są ulepszone i zawierają lac rep resor. Potem widzimy sekwencję RBS
(musi być dostarczona jako właściwa komórkom prokariotycznym), potem mamy sekwencję ATG jako
pierwszy kodon on zwykle też jest dostarczany z wektorem, rzadko kiedy musimy go z genu
dostarczać, i potem mamy sekwencję kodującą sześć reszt histydylowych i to jest znacznik do
chromatografii powinowactwa. Są różne warianty wektorów które posiadają taki znacznik. Niektóre
umieszczają reszty histydylowe na N-końcu białka, inne na C-końcu. Są też taki wektory które
zawierają i GST i znacznik histydylowy, albo innego rodzaju znaczniki wymieszane. Wszystko zmierza
do tego aby móc efektywnie oczyścić białko. Ale wróćmy do naszego prostego wektora. Czyli mamy
fragment kodujący sześć reszt histydylowych, przynajmniej sześć (są tez takie gdzie jest więcej)
potem mamy miejsce wielokrotnego klonowania gdzie wbudowujemy sekwencję kodującą białka,a
potem mamy kodony STOP. Są trzy kodony STOP i każdy kontroluje inną ramkę odczytu. Wróćmy do
sekwencji sześciu histydyn. Reszty histydylowe bardzo łatwo tworzą kompleks z jonami niklu i kobaltu
na +2 stopniu utlenienia. kompleks jest bardzo trwały. Oddziaływanie tych reszt histydylowych z
jonami niklu są tak silne, że nawet w warunkach denaturujących kompleks nie ulega dysocjacji. Czyli
nawet w obecności chlorowodorku guanidyny który rozwija cząsteczki białka ten kompleks jest ciągle
trwały. Jest to oddziaływanie specyficzne. W niektórych białkach, również bakteryjnych występują
takie ciągi reszt histydylowych, ale przewagą białka rekombinowanego jest to ze występuje ono w
komórce w stężeniu o wiele większym niż białko bakteryjne, więc jeżeli użyjemy chromatografii
powinowactwa, do izolacji takiego białka to będzie ono preferencyjnie wiązane ze złożem kolumny,
natomiast bakteryjne białka tylko w niewielkim stopniu. Natomiast jeśli mamy pecha i białko
rekombinowane nie jest ekspresjonowane w komórce to wtedy tylko bakteryjne się wiążą i człowiek
się cieszy dopóki się nie zorientuje ze to jest cos co nie powinno mieć miejsca.
Mamy więc wektor w
którym ekspres jonujemy
fragment sześciu reszt
His, tu jest miejsce
wielokrotnego
klonowania. Ta sekwencja
pomarańczowa jest
sekwencją dodatkową
która jest rozpoznawana
przez proteazę czyli
możemy odtrawić reszty
histydylowe jakby ktoś
chciał. No i mamy
komórkę bakteryjną w
której są produkowane
różne białka, w tym nasze
białko znakowane ciągiem
reszt His. Komórka po
ekspresji jest lizowana i
nanosimy ekstrakt na złoże do chromatografii powinowactwa. I to złoże musi zawierać Ni2+ albo Co2+.
Jedne i drugie tworzą specyficzny kompleks z sześcioma His. Na początku odmywane są białka które
niespecyficznie wiążą się ze złożem. Zwykle tak jest ze w chromatografii powinowactwa najpierw
odmywamy to co jest ze złożem niespecyficznie związane, a następnie kolumna poddawana jest
elucji specyficznej czyli eluowane białko specyficznie związane ze złożem. Elucja może być
przeprowadzana na różne sposoby. W chromatografii powinowactwa jako substancji która służy
elucji używa się tej samej substancji, która jest związana z kolumną. A wiec w tym wypadku można
użyć histydyny, czego nikt nie robi ale teoretycznie jest to możliwe. Zazwyczaj używa się imidazolu
czyli substancji która pod względem chemicznym jest pokrewna histydynie. I jeżeli użyjemy imidazolu
w dostatecznie dużym stężeniu, nasze białko jest eluowane ze złoża. Można też w przypadku tej
chromatografii przeprowadzać elucję na inne sposoby np. zmieniając pH. Imidazol jest bowiem
zdolny do interakcji w pewnym zakresie pH, również reszty histydylowe. I teraz jeśli doprowadzimy
do takiego pH w którym reszty His nie będą w tej formie która gwarantuje oddziaływanie to białko
będzie eluowane ze złoża. Ja osobiście nie przepadam za tą formą elucji gdyz jeśli nic nie wiemy o
białku to zawsze istnieje obawa, że jeśli użyjemy pH drastycznie innego iż to w którym pracowaliśmy,
białko może stracić aktywność albo denaturować. Teraz mamy kolumne z której wyeluowaliśmy
białko. I teraz jak pamiętamy jest
wbudowane miejsce rozpoznawane
praez proteazę.
Tą konkretną proteazą w tym przypadku
jest enterokinaza. Korzystając z
enterokinazay odtrawiamy fragment
sześciu His. I mamy w roztworze nasze
białko i krótki peptyd. I możemy teraz,
żeby mieć zupełnie czysty preparat,
pozbyć się peptydu jeszcze raz nanosząc
na kolumnę powinowactwa. Wtedy ze
złożem zwiąże się peptyd, a białko
wypłynie z kolumny. W ten sposób
otrzymujemy białko. Jeśli ktoś ma
bardzo dużo szczęścia to postępując tak
jak opisałem, przechodząc tylko przez
jedną kolumnę chromatografii
powinowactwa może trzymać właściwie
homogenne białko co jest dużym
wyczynem bo gdy normalnie korzysta się
z typowych technik chromatograficznych
trzeba wykonać kilka kolumn różnego
rodzaju aby otrzymać czysty preparat,
natomiast tutaj chromatografia
powinowactwa pozwala na, jeśli nie na
oczyszczenie całkowite to
zdecydowanym stopniu na pozbycie się
zanieczyszczeń. W naszym zespole
zarówno korzystając z pochodnych GST,
jak i z reszt His ekspres jonowaliśmy i
oczyszczaliśmy kilkadziesiąt różnych
białek w tym pochodnych mutantów (?).
Z reguły nie udawało nam się w jednym etapie oczyszczać, zawsze było coś jeszcze potrzebne,
zazwyczaj sączenie molekularne aby otrzymać preparat czysty, choć często i to nie pozwala na
oczyszczenie do stanu homogennego.
Gdyby ktoś chciał ekspresjonować białko w życiu, jaki jest najbardziej typowy sposób ekspresji?
Wektorów jest mnóstwo, jest mnóstwo różnych technik. Wynika to z tego, że jeśli pracujemy z
cząsteczkami DNA to te same metody badawcze, trawienie enzymem, ligacja itd.to możemy odnosic
w pewnym zakresie do wielu różnych cząsteczek i tu nie ma większych niespodzianek. Natomiast jeśli
chodzi o białka jest po prostu niepowtarzalne. Nawet podstawienie jednego aminokwasu często
zmienia właściwości białka tak że mamy do czynienia z zupełnie innym obiektem. Także każdy obiekt
wymaga indywidualnego podejścia, poznania tej cząsteczki, żeby ją po prostu badać. I teraz jaki byłby
najbardziej efektywny sposób aby ekspresjonować białka, jak to należy robić? Otóż wiele porównań
eksperymentów ekspresji daje taką konkluzję, iż jeśli nic nie wiemy o takim białku to należy je
ekspresjonować w taki sposób aby zaopatrzyć je na N-końcu ciągiem reszt His, najlepiej sześciu. Od
tego należy zacząć badanie. Jeżeli ma się szczęście to w takim układzie otrzyma się z najlepsza
wydajnością produkt który powinien być rozpuszczalny. Nie ma sensu zaczynać od razu od łączenia
białka z GST, tak samo nie ma sensu zaczynać od dołożenia dwóch znaczników, no chyba że od razu
wiemy iż jest to konieczne ze względu na degradację. Najwięcej bowiem takich zakończonych
sukcesem eksperymentów nadekspresji białka polegało na tym że znacznik histydylowy był
umieszczony na N-końcu.
Dziękuję skończyłem.
... zobacz całą notatkę



Komentarze użytkowników (0)

Zaloguj się, aby dodać komentarz