To tylko jedna z 5 stron tej notatki. Zaloguj się aby zobaczyć ten dokument.
Zobacz
całą notatkę
Drożdżowe systemy ekspresyjne
Każdy system ekspresyjny składa się z wektora ekspresyjnego oraz komórek gospodarza
Drożdżowe systemy ekspresyjne to wektory wahadłowe, cechy:
Mają część bakteryjną i drożdżową
Część bakteryjna:
Ori - msce startu replikacji
Marker selekcyjny dla bakterii np oporność na ampicylinę
Część drożdżowa:
Drożdżowy marker selekcyjny
Ars- sekwencja ori drożdżowa
Miejsce wklonowania sekwencji z promotorem
6.1 Sekwencje promotorowe i terminatorowe w systemie ekspresji u P.pastoris:
Wektory plazmidowe stosowane w P.pastoris zawierają:
Sekwencje promotorowe AOX1, FLD1, GAP, PEX8, YPT1
Sygnał terminacji i transkrypcji AOX1.
Odpowiednie promotory powodują, że jakieś organizmy rosną na tanich podłożach np. metanolu, ale też może się też okazać, że substrat będzie indukował działanie promotora.
Promotory są indukowane:
AOX- metanolem
FLD- metanolem lub metyloaminą
Markery selekcyjne P.pastoris:
Sh ble- gen oporności na Zeocynę
Markery auksotroficzne- geny HIS4
Inne merkery selekcyjne np URA3 czy ADE1.
Integracja wektorów z genomem P.pastoris:
Do integracji dochodzi w obrębie promotora AOX1, promotora GAP lub sekwencji markera selekcyjnego, na drodze rekombinacji homologicznej.
W wyniku transformacji liniową formą DNA plazmidowego jedna kopia wektora włączana jest do genomu P.pastoris. Możliwe jest jednak skonstruowanie szczepów rekombinantów zawierających więcej kopii obcego genu o obrębie genomu.
Szczepy P.pastoris:
Wszystkie ekspresyjne szczepy P.pastoris pochodzą od szczepu Y-11430 i zawierają mutacje w jednym lub kilku genach, objawiające się odpowiednią auksotrofią.
Większość ekspresyjnych szczepów P.pastoris podobnie jak szczep dziki, zawiara dwa geny oksydazy alkoholowej AOX1 oraz AOX2 i jest zdolna do szybkiego wzrostu w pożywce zawierającej metanol (fenotyp Mut+).
Skonstruowano jednak szczepy posiadające delecję w obrębie genu AOX1, które wolno rosną w pożywce z metanolem, jednak w niektórych przypadkach produkują heterologiczne białka z większą wydajnością i nie wymagają do ekspresji genów tak dużej ilości metanolu jak szczepu Mut+, co jest szczególnie ważne przy produkcji białek na skalę przemysłową.
Przykładem takiego szczepu jest P.pastoris KM71, gdzie gen AOX1 został częściowo usunięty i zastąpiony genem ARG4 S.cerevisiae.
6.2 Promotory H.polymorpha
(…)
… dihydroksyacetonu (DHAS) i dehydrogenazy mrówczanowej (FMD)
2) Słabszy promotor genu oksydazy aminowej (AMO), którego induktorami są pierwszorzędowe aminy np metylo i metyloamina, aż całkowita represja występuje w obecności jonów amonowych
3) Promotory genów kodujących enzymy szlaku asymilacji azotanów (YNT1, YNI1, YNR1)- rzadziej wykorzystywane. Indukcja przez azotany, a represja w obecności jonów amonowych
4) Silnie konstytutywne promotory to PMA1 (promotor genu ATPazy błony cytoplazmatycznej i GAP (promotor genu dehydrogenazy aldehydu 3-fosfoglicerynowego).
Merkery selekcyjne H.polymorpha:
LEU1.1
URA3
TRP3
ADE11
Geny LEU2 i URA3 S.cerevisiae
Geny oporności na antybiotyki- pleomycynę i zeocynę
Wektory w komórkach H. polymorpha mogą być:
Replikowane w sposób autonomiczny:
Autonomiczną replikację wektorów…
… od składu pożywki hodowlanej, lecz zależna od fazy wzrostu hodowli Y.lipolytica (tylko faza stacjonarna), liazy izocytrynianowej (ICL1), oksydazy acylo-CoA (POX2)
i tiolazy 3-okso-acylo-CoA (POT1)
indukcja przez kwasy tłuszczowe i n-alkany, octan, etanol, represja glukoza lub glicerol
Markery stosowane u Y.lipolytica:
1) Auksotroficzne:
LEU2
URA3
ADE1
2) Inne:
Gen oporności na pleomycynę
Gen SUC2 inwertazy…
… nie posiada własnej sekwencji sygnalnej, najbardziej uniwersalna jest sekwencja prepro peptydu alfa-faktora S.cerevisiae
U P.pastoris i H.polymorpha stosuje się ponadto pro sekwencje kwaśnej fosfatazy lub glukoamylazy Schwanniomyces occidentalis
U Y.lipolitica sekwencje prepro peptydu zewnątrzkomórkowej alkalicznej proteazy lub lipazy
Białka opiekuńcze i foldazy:
Poziom sekrecji obcych białek można zwiększyć…
... zobacz całą notatkę
Komentarze użytkowników (0)