To tylko jedna z 2 stron tej notatki. Zaloguj się aby zobaczyć ten dokument.
Zobacz
całą notatkę
Geny reporterowe- markery IG
Kodują białka, których obecność/ aktywność biochemiczną łatwo oznaczyć w komórce (in vivo) technikami biochemicznymi., autoradiografią, spektrofotometrią lub bio i chemiluminescencją.
Łączone w fuzje z sekwencjami, które chcemy analizować (np. gen o nieznanej cesze, regionami regulatorowymi).
Wprowadzane są do badanych komórek lub organizmów na drodze transformacji lub transfekcji. Efekt ekspresji może być stały lub przejściowy (ulegają lu nie integracji z genomem biorcy).
Konkretny gen reporterowi stosowany jest w danym systemie badawczym jeśli system jest pozbawiony endogennego genu homologicznego. Niezbędne jest również zastosowanie wektora ekspresyjnego, który umożliwi efektywne wyrażenie białka kodowanego przez gen reporterowi w badanym układzie.
Geny reporterowe- zastosowanie:
Wykorzystywane m.in. w ustalaniu regionów promotorów odp za regulację genów- tworzenie fuzji fragmentów potencjalnego promotora z genem reporterowym- transfekcja komórek- szacowanie aktywności promotora na podstawie oznaczania aktywności białka kodowanego przez gen reporterowi. W analogiczny sposób można przeprowadzić analizę czasowej lub przestrzennej aktywności badanych promotorów w komórkach.
Ustalanie wewnątrzkomórkowej lokalizacji białek- tworzenie fuzji cDNA kodującego badane białko z genem reporterowym (np. białkiem zielonej fluorescencji GFP) lub jego wariantem i analiza mikroskopowa.
Zastosowanie genów reporterowych- cechy:
Ustalanie regionów promotororów odp za aktywność genów, szacowanie aktywności promotora
Analiza czasowej lub przestrzennej aktywności badanych promotorów w komórkach
Produkt daje łatwo dostrzegalną fenotypową zmianę (np. synteza barwnika, świecenie, scyntylacje)
Nie powoduje zakłóceń fizjologicznych w org- biorcy
Produkt stosunkowo nietrwały
Kodowane przez ten gen białko zachowuje swoją aktywność po przyłączenie do końca (N lub C) innego peptydu
Brak w komórkach endogennego genu homologicznego
Ułatwiają wewnątrzkomórkową lokalizację białek (fuzje cDNA kodującego badane białko z genem reporterowym)
Geny reporterowe- przykłady:
β-galaktozydaza (β-gal)- enzym kodowany przez gen lacZ z E.coli. Oznaczenia aktywności β-gal polega na użyciu jako substratu X-gal, który jest rozkładany do barwnego (niebieskiego) produktu. Ilość produktu reakcji mierzona kolorymetrycznie. Zabarwienie można też obserwować w komórkach transformowanych wektorami z β-gal.
Lucyferaza- enzymy kodowane przez geny luc (m.in. u robaczka świętojańskiego).
(…)
… kodowane przez geny luc (m.in. u robaczka świętojańskiego).
Katalizują bioluminescencyją reakcję przemiany substratu- lucyferyny, ta ulega utlenieniu i przechodzi w stan wzbudzenia, następnie- powracając do stanu wyjściowego powoduje emisję światła. Emitowane fotony są zliczane (luminomets). Całkowita emisja światła jest proporcjonalna do aktywności luc w badanej próbce i pozwala na oszacowanie aktywności transkrypcyjnej genu reporterowego.
β-glukoronidaza (GUS)- enzym kodowany przez gen bakteryjny, wykorzystywany w badaniu ekspresji genów roślin. Stosowany jako reporter pomimo faktu występowania homologicznego genu w org roślin (optymalne pH dla enzymu bakteryjnego jest znacznie wyższe niż w przypadku enzymu endogennego). Substratem w oznaczaniu aktywności GUS jest X-gluc, reakcja analogiczna jak w przypadku β…
... zobacz całą notatkę
Komentarze użytkowników (0)