Geny reporterowe - omówienie

Nasza ocena:

3
Pobrań: 91
Wyświetleń: 854
Komentarze: 0
Notatek.pl

Pobierz ten dokument za darmo

Podgląd dokumentu
 Geny reporterowe - omówienie - strona 1  Geny reporterowe - omówienie - strona 2  Geny reporterowe - omówienie - strona 3

Fragment notatki:

GENY REPORTEROWE
Jeśli chcemy dokonać transformacji pożądanym transgenem musimy posiadac metody
weryfikacji udanej transformacji i/lub selekcji transformowanych komórek. Cel ten
osiągamy tworząc konstrukty zawierające oprócz pożądanego transgenu geny
reporterowe (pozwalają wizualnie odróżnić tkanki/komórki transformowane od
nietransformowanych) oraz geny selekcyjne (pozwalają na selekcję komórek transformowanych).
GFP
Meduza:
Zielone białko fluorescencyjne wyizolowane z meduzy Aequoria victoria , wykorzystującej GFP do transferu energii, w wyniku którego niebieska chemiluminescencja białka aequorin zostaje przekształcona w zielone światło GFP.
ma ona świecące punkty na obrzeżach kapelusza
światło pochodzi z żółtych mas tkankowych zbudowanych z 6-7 tysięcy komórek fotogennych
Cytoplazma wypełniona drobnymi ziarnistościami niezbędnymi do bioluminescencji
Świecenie: Białko GFP zbudowane jest z 238 aminokwasów, z których trzy odgrywa zasadniczą rolę w fluorescencji. Są to Ser65, Tyr66 oraz Gly67. Taki tripeptyd można by zapewne znaleźć w sekwencji aminokwasowej wielu innych białek, jednak żadne z nich nie wykazuje zdolności fluorescencyjnych. Wynika to z faktu, iż grupa chromoforowa GFP (Ser65- dehydroTyr66 - Gly67) ulega cyklizacji, a tyrozyna dodatkowo zostaje poddana oksydacji .
Dzieje się to w trakcie auotoaktywacji chromoforu, która nie wymaga obecności żadnych kofaktorów ani składników enzymatycznych, jest jednak wrażliwa na podwyższenie temperatury. Najwolniejszym etapem aktywacji, decydującym o szybkości całego procesu jest oksydacja tyrozyny
Grupa chromoforowa wykazuje maksymalna absorpcję światła przy 395nm oraz 475 nm, zaś maksimum emisji przy 508 nm. Przed niekorzystnymi wpływami środowiska chroniona jest dzięki umieszczeniu jej wewnątrz ß-puszki - struktury, jaką przyjmuje białko GFP
Aequoryna aktywowana jest jonami wapnia. Jest to fotogenne białko emityjace świtało zielono-niebieskie
GFP to białko pomocnicze-akceptor energii z aequoryny, reemityjace się w postaci zielonego świtła
Zastosowanie: do śledzenia interakcji pomiędzy proteinami oraz lokalizacji białek w organizmie.
stosowany jest jako gen reporterowy w badaniach aktywności promotorów i poziomu ekspresji genów znajdujących się pod ich kontrolą. do wizualizacji żywych komórek-brak artefaktów-pochodnych utrwalania i barwienia
ujawnianie organizmów chimerycznych- wczesne etapy regeneracji
Zalety:
wizualizacja łatwa- pod wpływem światła UV fluoryzuje na zielono
Jest małe i może być doczepiane do innych białek co umożliwia monitorowanie ich zachowania w komórce.


(…)

…:
- polimeraza II RNA odpowiada za transkrypcję genów kodujących białka. Nie jest ona w stanie sama rozpoznać sekwencji promotora. Dlatego geny Eukaryota nie są aktywne transkrypcyjnie pod nieobecność takich czyników jak na przykład białko TBP, które wiąże się z TATA box
- występują liczne polimerazy RNA
-zwinięcie w nukleonom stanowi barierę dla transkrypcji
- separacja jadra od cytoplazmy powoduje…
… przez sekwencje GC bogate, tu przyłącza się polimeraza RNA II i czynniki transkrypcyjne dla uformowania kompleksu transkrypcyjnego
- GC box- otacza TATA box, jest w wielu kopiach
- CAP site- rzeczywisty punkt startu transkrypcji
-miejsca regulatorowe rozrzucone na duże odległości od promotora
DZIAŁANIE POLIMERAZY II RNA
-działa w połączeniu z innymi czynnikami inicjującymi transkrypcję, które rozpoznają sygnały…

zmienia się właściwości spektralne- na przykład posiadanie podwójnego piku wzbudzenia.
Wykorzystuje się dwa główne typy wektorów bazujących na plazmidzie Ti:
-wektor kointegracyjny (pojedyncza jednostka replikacyjna) - zawiera zarówno geny
wirulencji jak i transgeny oraz geny reporterowe.
-wektor binarny (transgen wprowadzony do genomu roślinnego znajduje się na odrębnej
jednostce replikacyjnej). Wektor…
… większych transgenów. GUS
uidA zwany popularnie „genem GUS”
tetrameryczna glikoproteina złożoną z czterech identycznych podstawników o masie cząsteczkowej 68 kDa ulokowana przeważnie w kwaśnym środowisku lizozymu.
Pochodzenia bakteryjnego -wyizolowaną z komórek Escherichia coli koduje enzym katalizujący hydrolizę beta-glukuronidów wśród nich syntetyczne substraty jakie jak MUG czy X-gluc na skutek czego…
... zobacz całą notatkę

Komentarze użytkowników (0)

Zaloguj się, aby dodać komentarz