kwasy nukleinowe i enzymy

Przedmiot ten jest wykładany na II roku na Uniwersytecie Rolniczym w Krakowie, na kierunku ochrona środowiska. Prowadzi go prof. dr hab. Marcin Rapacz. Tematy jakie zawiera opracowanie to: hydroliza (wykrywanie składników kwasów nukleinowych), izolacja DNA z warzyw i owoców metodą uproszczoną, spektrofotometryczne oznaczanie zawartości kwasów nukleinowych i badanie ich czystości, jakościowa analiza kwasów nukleinowych - reakcja PCR, detekcja bakterii Escherichia coli w glebie z wykorzystaniem reakcji PCR, pomiar ekspresji genów z wykorzystaniem techniki PCR w czasie rzeczywistym, oznaczanie aktywności kwaśnej fosfatazy (fosfomonoesterazy), wykazanie aktywności oksydaz w ziemniaku, wykazanie obecności katalazy w ziemniaku, spektrofotometryczne oznaczanie aktywności peroksydazy niespecyficznej, oznaczanie aktywności katalazy w ekstrakcie z roślin (EC: 1.11.1.6.).
                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                            

(…)

… w urządzeniu zwanym termocyklerem.
Termocykler zawiera blok grzejny z otworami na probówki, w których zachodzić może reakcja.
Powielenie (amplifikacja) zachodzi na drodze enzymatycznej katalizowanej przez termostabilną
polimerazę DNA (otrzymaną z bakterii Thermus aquaticus, które żyją w gorących źródłach w
temperaturze często przekraczającej 100°C). Enzym do rozpoczęcia syntezy komplementarnej
nici DNA…
… (ang. reverse
transcription PCR) oraz PCR w czasie rzeczywistym (ang. real time PCR).
W reakcji RT-PCR jako matrycę wykorzystuje się cząsteczki matrycowego RNA. Pierwszy
etap katalizowany jest przez odwrotną transkryptazę (polimerazę DNA zależną od RNA), która
syntetyzuje komplementarne cDNA na matrycy RNA. Utworzone cDNA jest następnie
amplifikowane w reakcji PCR. Za pomocą reakcji RT-PCR można zatem…
… od zanieczyszczeń przypadkowym DNA. Należy używać sterylnych
probówek i końcówek do pitet, wody o odpowiedniej czystości. W czasie pracy należy nosić
ubranie ochronne i rękawiczki.
Odczynniki i materiały:
- bufor do PCR 10x
- trifosforany deoksyrybonukleotydów o stężeniu 10 mM
- startery specyficzne do analizowanej sekwencji o stężeniu 10 µM
- polimeraza DNA Taq o stężeniu 5u/µl
- MgCl2 o stężeniu 25 mM
- agaroza…
…:
Tabela 1. Skład mieszaniny reakcyjnej- Reakcja PCR.
Składnik mieszaniny
Objętość/reakcję
Stężenie w reakcji
woda
11,7 µl
-
bufor do PCR 10x
2 µl
1x
dNTP 10 mM
0,5 µl
0,25 mM
starter „forward” 10 µM
1 µl
0,5 µM
starter „reverse” 10 µM
1 µl
0,5 µM
polimeraza DNA Taq 5u/µl
0,2 µl
0,05 u/µl
MgCl2 25 mM
1,6 µl
2 mM
matryca DNA
2 µl
zależne od wydajności
izolacji
Suma
20 µl
-
2. Sporządzić 1% żel agarozowy…
… fosforomolibdenianu amonowego. Po dodaniu paru kropel 1%
roztworu kwasu askorbinowego (witamina C) następuje redukcja molibdenianu amonowego do
mieszaniny tlenków molibdenu (Mo2O5MoO3), tzw. błękitu molibdenowego.
c) Wykrywanie zasad purynowych:
2 cm3 hydrolizatu ogrzać do wrzenia, dodać kilka kropel roztworu 0,25 M CuSO4 i ostrożnie
kroplami dodawać nasycony roztwór Na2SO3. W obecności puryn wytrąca się żółtobiały…
… z fluoroforem, która generuje fluorescencję o intensywności proporcjonalnej do ilości
powstałego produktu PCR.
Odczynniki i materiały:
- TaqMan MGB Probes
- Sequence Detection Primers
- TaqMan Universal PCR Master Mix
- sterylne, wolne od rybonukleaz końcówki do pipet, probówki typu „ependorf”, płytka do
reakcji PCR, folia adhezyjna
- woda wolna od nukleaz
Procedura:
1. Przygotować „master-mix” dla procesu PCR…
… powielać transkrypty
(mRNA) różnych genów.
PCR w czasie rzeczywistym umożliwia ilościowy pomiar kwasów nukleinowych. Do
mieszaniny reakcyjnej dodaje się związki, które emitują fluorescencję o natężeniu
proporcjonalnym do powstałego produktu PCR. Mogą być nimi związki wiążące się z każdym
dwuniciowym DNA (np. SYBR Green) lub też syntetyczne oligonukleotydy (sondy) specyficzne
do analizowanej sekwencji (Ryc…
... zobacz całą notatkę