Inżynieria genetyczna
Wykład 8, 13.04.2012, część II.
Wracamy do wykładu zatem, proszę państwa pierwszą z metod, która pozwala na określenie
miejsca interakcji białka z DNA, a także jak staram się Was przekonać także na wyciągnięcie bardzo
wielu szczegółowych informacji zapewnia nam metoda EMSA. Jej podstawowym problemem jest to,
że eksperyment wprost jaki jest wykonywany EMSA nie daje szczegółowych informacji na temat
oddziaływań. Dodatkowe informacje szczegółowe można oczywiście otrzymać poprzez mutagenezę,
co oczywiście wymaga nakładu pracy i środków. Zatem powstały techniki alternatywne, które
pozwalają na uzyskanie informacji bardziej szczegółowych, co pozwala wnosić coś na temat reszt
które są zaangażowane w oddziaływania, a także informacji które nam ograniczają obszar
oddziaływania. Zauważmy, że w eksperymencie EMSA, który tu pokazaliśmy zaobserwowano tylko iż
fragment 3 oddziałuje z białkiem, natomiast nie można było na podstawie tego eksperymentu
określić jaka część fragmentu 3 jest zaangażowana w oddziaływania. Aby to stwierdzić trzeba by
dokonywać kolejnych delecji, fragmentacji i ograniczyć obszar analizowany i wreszcie dokładnie
określilibyśmy obszar oddziaływania z białkiem. EMSA nie pozwala na ścisłe zdefiniowanie obszaru
oddziaływania, zawężenie jego do tego minimum potrzebnego do tworzenia kompleksu.
Temu celowi natomiast służy technika, w której wykorzystuje się DNAzę I. DNaza I jest
enzymem, nukleazą, która trawi DNA w sposób niespecyficzny. Jeżeli mamy fragment typu DS (albo
ds, nie wiem co to :P), ten fragment jest trawiony przez DNazę. DNaza I zatem trawi cząsteczki w
sposób niespecyficzny. Nie wykazuje ona żadnych preferencji jeśli chodzi o sekwencję. Teraz warto
spojrzeć na to co jest pokazane na zilustrowanym schemacie:
Rysunek 1.A bound protein protects a region of DNA from degradation by a nuclease such as DNase I.
Jeżeli białko, jakieś regulatorowe, białko, którego oddziaływanie z DNA analizujemy, jeśli
takie białko tworzy kompleks z DNA, wtedy DNA zaangażowany w kompleks jest chroniony przed
DNazą I. DNaza I nie ma po prostu dostępu do wiązań fosfodiestrowych, które są przesłaniane przez
białko oddziałujące z fragmentem DNA. To jest jakby istota tego eksperymentu, w którym występuje
DNaza I, w którym wykorzystujemy DNazę I. Eksperyment, o którym mówię był bardzo pobieżnie
omawiany w podręczniku Berga, Srajera i nosi on nazwę footprintingu DNazą I. Czyli odcisk stopy ee,
e.. otrzymywany przez DNazę w eksperymencie trawienia DNazą I.
Rysunek 2. DNase I footprinting | 1.
Parę słów na temat tego eksperymentu, a w szczególności warunków, w których się go
wykonuje, czego nie było mowy w Bergu, Srajerze jak sądzę. E..eksperyment, wykonywany jest w ten
sposób, iż na początku DNA musi być jakoś otrzymany. Można go otrzymać metodą PCR lub też po
prostu wyciąć fragment z jakiegoś wektora. Taki DNA znakowany jest na końcu. Dla tego
eksperymentu własciwym znakowaniem jest jakie znakowanie? Na jednym z 5’ końców, albo na 3’
końcu, ale musi to być zaznakowany jeden koniec, czyli jak mamy dwa końce cząsteczki typu DS, to
tak jak w eksperymencie ochrony przed nukleazą S1 tym drugim, który omawiałem musimy mieć
zaznakowany tylko jeden koniec DNA. Najprościej jest to uzyskać przy pomocy kinazy T4. Czyli mamy
DNA, jak tu jest napisane zaznakowany na końcu i teraz dodajemy białko regulatorowe, które wiąże
się z DNA i przeprowadzamy trawienie DNazą. I teraz pierwszy bardzo ważny punkt w tym
eksperymencie, otóż trawienie DNazą jest przeprowadzane w takich warunkach, aby DNaza trawiła w
każdej z cząsteczek, które występują w roztworze tylko jedno wiązanie fosfodiestrowe. Wróćmy do
naszej ilustracji, tutaj mamy pokazaną sytuację następującą; jest białko wiążące DNA, a DNaza jest
obecna w takim stężeniu, iż każde wiązanie fosfodiestrowe, które nie jest zaangażowane w kompleks
jest trawione. Powstają pojedyncze nukleotydy (Rysunek 1). Tak się nie robi w eksperymencie
footprintingu. W tym eksperymencie stężenie DNazy jest tak dobrane, iż jak to pokazała ta ilustracja
każda z cząsteczek kompleksu, a więc tego co tworzy DNA i białko, jest trawiona tylko jeden raz, czyli
jedno wiązanie fosfodiestrowe. Gdyby było inaczej nie moglibyśmy niczego wnosić na temat tego
oddziaływania, co jasno wyniknie z następnej ilustracji. Oczywiście to jest możliwe dlaczego? Dlatego
że w roztworze mamy wiele cząsteczek tego samego fragmentu DNA, on nie jest jeden, tylko jest ich
wiele i też jest DNaza w postaci wielu molekuł, ale jest ich tak mało, że szansa strawienia więcej niż
jednego wiązania fosfodiestrowego jest zminimalizowana. Zatem z kolekcji kompleksów,
fragmentów, które są w kompleksach dostajemy po ograniczonym trawieniu DNazą I dostajemy
kolekcję pofragmentowanych molekuł. I teraz to jest niejako eksperyment właściwy. W
eksperymencie kontrolnym ten sam fragment DNA, czy ta sama cząsteczka DNA reprezentowana w
postaci wielu molekuł jest trawiona DNazą w nieobecności białka. W tym eksperymencie dostajemuy
z kolei kolekcję produktów trawienia również otrzymanych w warunkach ograniczonej ilości cząst.
DNazy, a więc ta kolekcja obrazuje wynik trawienia każdego z możliwych wiązań fosfodiestrowych.
Mamy po prostu kolekcję fragmentów, których długość różni się o jedną resztę, które są jednym ze
skutków trawienia. Dlaczego mamy kolekcję fragmentów coraz to krótszych? Otóż tak naprawdę
przecinane są pojedyncze wiązania fosfodiestrowe w cząsteczce DS, ale to co widzimy na końcu
eksperymentu to jest tylko jedna z nici. Jasne? Bo jedna z nici jest zaznakowana radioaktywnie. To
jest jasne? (nie xD) Trawienie DNazą I można przeprowadzać na cząst. DS na dwa sposoby; mogą być
trawione oba wiązania fosfodiestrowe w cząst. DNA, bądź może być nacinane w jednej z nici i tak jest
w eksperymencie footpringtingu DNazą, jest nacinana jedna z nici, druga pozostaje niezmieniona z
reguły. Zauważmy, że tylko jedna z nici jest zaznakowana radioaktywnie, więc produkty trawienia tej
radioaktywnie znakowanej nici są dla nas widoczne, jeżeli nić radioaktywnie znakowana jest
trawiona, czyli jest przecinane, hydrolizowane jedno z wiązań to dostajemy dwa produkty z tej nici,
jeden i drugi, z czym tylko jeden jest znakowany. Jeden jest znakowany i tylko ten jeden znakowany
widzimy. Poraz kolejny żałuję, że nie mam flamastra. Może znajdę jakiś dobry, momencik. Koniec
świata – są rzeczywiście. Wyobraźcie sobie, duża cząsteczka typu DS, one są wszystke jednakowej
długości i teraz yy, DNaza strawiła powiedzmy to wiązanie, w tej to, w tej to (...) i teraz znakowanie
jest na 5’ końcu, tak?
To jest bezsensu, bo on gada „to tamto i to, to jest to”, nie wiem o które mu chodzi i coś tam
sobie malował na tablicy – pominę ten fragment. „To pokazane jest w tym miejscu.” XD
Teraz może wróćmy do naszego schematu przed anihilacją częsci (hehe) coś tam. Jeżeli mamy
oddziaływanie...takie trawienie jest możliwe, takie jest możliwe, natomiast to...
Zatem z kolekcji fragmentów wypadnie część i to jest footprint i teraz skąd wiemy, że to się
stało? O tym nas informuje elektroforeza, a więc wykonujemy elektroforezę z tych dwóch próbek , z
próbki kontrolnej, gdzie mamy kolekcję wszystkich fragmentów i z próbki właściwej. Nie wiem o co
mu tam chodzi :D „Co to jest, to nie wiem? Jakiś kolejny błąd w pliku, w którym są ilustracje, tu
powinno być Lane 1 control – no bound protein, Lane 2 – test DNA no bound protein. „Nie no tu
brakuje liter, hehe to jest ciekawe”. To jest nasz eksperyment footprintingu. On jest obarczony
pewną wadą, pewną niedogodnościa. Gdyby to był promotor genu HS27, to po takim eksperymencie
mielibyśmy tą sekwencję, którą musielibyśmy badać.
Rysunek 3. DNase I footprinting | 2.
Jest jeszcze znana inna metoda, która pewną niedogodność footprintingu pokonuje. Otóż tak
naprawdę to jeżeli mamy oddziaływanie z białkiem to chronionym obszarem jest często większy
obszar niż ten, który rzeczywiście jest chroniony(?) w oddziaływaniu, czyli reszty które tworzą
kontakty z białkiem bardzo często mogą być skupione na mniejszym fragmencie DNA niż który jest
chroniony.
... zobacz całą notatkę
Komentarze użytkowników (0)