Test kometowy
SCGE
Służy m.in. ocenie cyto i genotoksyczności związków chemicznych. Umożliwia wizualizację uszkodzeń DNA w poszczególnych komórkach. Niewielka liczba komórek zawieszana w warstwie agarowy na szkiełku mikroskopowym poddawana lizie (detergenty) i elektroforezie. Celem uwidocznienia zmian jakim uległy komórki pod wpływem czynnika chemicznego/ fizycznego, preparaty wybarwiane są barwnikami fluorescencyjnymi wiążącymi się z DNA. Pęknięte nici DNA migrują jako ogon komety. Ilość uwolnionego z jąder materiału genetycznego proporcjonalna do intensywności i czasu działania dawki promieniowania/ czynnika chemicznego jakim traktowane były komórki.
Obraz przypomina kometę. DNA pozostające w obrębie otoczki jądrowej formuje „głowę”. „Ogon” złożony jest z wolnych fragmentów DNA (wędrują szybciej i dalej od tych, zakotwiczonych w macierzy jądrowej), a intensywność fluorescencji i długość ogona odzwierciedlają liczbę pęknięć DNA. Wyższe stężenia związków toksycznych nie powoduje zmian w długości ogona, różnice dotyczą poziomu fluorescencji.
Etapy i ocena wyników testu kometowego:
Podstawowy model techniki obejmuje następujące etapy:
1) Izolacja pojedynczych komórek z materiału badawczego
2) Pokrycie szkiełek agarową (jedna, dwie lub trzy warstwy, o różnych stężeniach i temp topnienia), odmienne obrazy komet
3) Liza komórek (Tryton- X100, SDS)
4) Elektroforeza szkiełkowa
5) Barwienie preparatów i wizualizacja w mikroskopie fluorescencyjnym (barwniki- DAPI- wiąże się selektywnie z parami AT, bromek etydyny- interkaluje między zasady azotowe, jodek propidyny, oranż akrydyny).
Błękit bromofenolowy- ok. 500pz
Zieleń ksylenowa- ok. 1000pz
Nie wiążą się z kw nuk, migrują niezależnie, bo mają swój własny ładunek.
Oceniane parametry komet:
Długość ogona
Długość komety
Intensywność fluorescencji ogona
Tzw moment ogonowy (iloczyn długości ogona i intensywności fluorescencji)
Zalety metody:
Czułość wykrywania uszkodzeń DNA
Niewielka ilość materiału niezbędna do przeprowadzenia testu
Krótki okres uzyskania wyników
Relatywnie niskie koszty eksperymentów
Do oceny uszkodzeń komórek niezbędne są komputerowe programy analizy obrazu
... zobacz całą notatkę
Komentarze użytkowników (0)