To tylko jedna z 4 stron tej notatki. Zaloguj się aby zobaczyć ten dokument.
Zobacz
całą notatkę
GENETYKA WYKLAD 9 - mapowanie fizyczne i klasyczne (genetyczne) - daje pełny obraz genów
- sekwencjonowanie i fragmentowanie DNA - enzymy restrykcyjne
- diagnoza - „finger print”
- PCR - poza komórką
kombinacja technik = umożliwia diagnostykę np. chorób, ustalenie ojcostwa (zastosowanie inżynierii (mapy restrykcyjne, diagnozy restrykcyjne)
~ klonowanie, izolowanie genów
- izolacja, określenie sekwencji, wprowadzenie do komórki gospodarza, uzyskanie ekspresji określonych genów = to b. ważne, konieczne etapy w badaniach, inżynierii
wektory:
markery selekcyjne
miejsca replikacji (plazmidy bakteryjne R6K, EcoRI - z nich konstruowane wektory)
wprowadzenie wyizolowanych genów: - transformacja - najczęstsza metoda
~ obecnie nienaturalnie ( in vitro ), do kompetentnych komórek gospodarza
- transdukcja
- koniugacja - małe zastosowanie
TRANSFORMACJA - w komórkach bakteryjnych proces łatwo można indukować, jest inna ściana komórkowa, łatwo DNA wnika do komórki (głównie u E. coli )
- konieczne wywołanie kompetencji w komórkach bakteryjnych do pobierania DNA ze środowiska
- gorzej u Eucaryota - trudno uczynić komórkę kompetentną
usunięcie ściany, np. drożdży, żeby DNA mogło wniknąć, uzyskanie protoplastu lub sferoplastu zachowana część ściany)
trzeba użyć dużo sorbitolu (dobre warunki osmotyczne, komórka bez ściany nie będzie pękać)
dodanie CaCl 2 - powoduje kompetencję (także u bakterii) - powoduje rozszerzenie porów
3-5 tyś. transformantów drożdżowych uzyskuje się z 1 μg DNA
trudności - odpowiednia temperatura agaru
- nieodpowiednia regeneracja ściany
- długa procedura
- metoda chlorku litu - usprawnienie procesu
kompetencja komórek drożdżowych
uzyskuje się mniej transformantów, ale duża wydajność reakcji i nie trzeba robić protoplastyzacji
rozluźnienie barier
kompetencja - zdolność do przyjęcia DNA
~ brane komórki z fazy logarytmicznej (nie stacjonarnej)
~ - ELEKTROPORATORY:
impuls elektryczny 2,7 kV/cm2 w czasie 1/15 ms = powoduje elektroporację, otwarcie kanałów i w efekcie pobranie DNA
bardzo duża wydajność procesu na 1 μg DNA (kilka mln)
sterowane komputerowo
u bakterii, drożdży, zwierząt, roślin
do organizmów wyższych stosuje się działo, kulki złote lub wolframowe ( patrz dalej )
- sens transformacji tylko wtedy, gdy gen ulega ekspresji
(…)
… fragmentów (polimeraza się myli; do kilku tyś. nukeotydów)
- problem z genami mozaikowymi
- introny trzeba zlikwidować - dlatego izolację prowadzi się na matrycach mRNA
IZOLACJA NA MATRYCACH mRNA
- wyspecjalizowane komórki organizmów zwierzęcych produkują specjalne białko (np. w jajowodach ptaków)
- mRNA to czynnik ekspresji genów jakiegoś białka, w pewnych komórkach dużo 1 typu mRNA
~ Temis i Baltimore…
… enzymem) i powstają rekombinanty
- cały genom w różnych częściach wektora (bank genów, biblioteka genowa); liczne kopie
~ przechowywane w postaci klonów bakteryjnych
~ duża liczba transformantów z wektorem i określonym fragmentem DNA - miliony komórek w banku genów, różne metody przechowywania i przekazywania; lub też w postaci DNA w temp. -70oC
metoda PRZECIWCIAŁ
- ekspresja genu, otrzymanie produktu…
... zobacz całą notatkę
Komentarze użytkowników (0)