To tylko jedna z 4 stron tej notatki. Zaloguj się aby zobaczyć ten dokument.
Zobacz
całą notatkę
Mutanty:
Otrzymywanie mutantów:
Do mutagenizacji wykorzystuje się takie szczepy, które są kompatybilne ze szczepami wyjściowymi znajdującymi się w laboratorium.
Do badań wykorzystuje się najczęściej A.nidulans veA1- szczep z Glasgow charakteryzujący się krótkimi konidioforami.
Mutagenizacja UV:
A.niger musi mieć większą intensywność naświetlania (180 J/m2) - ze względu na czarne spory
Inne szczepy z jasnymi sporami mniej (60 J/m2)
9.1 Selekcja i charakterystyka mutantów:
Metoda z zastosowaniem enzymów litycznych:
Konidiospory kiełkujące na stałym podłożu minimalnym są selektywnie zabijane przez enzym lityczny - zostają tylko mutanty, bo podkiełkowane giną.
Sukces tej metody zależy od:
Segregacja konidiów po mutagenizacji w celu otrzymania zsynchronizowanego kiełkowania
Czas inkubacji konidiów na podłożu minimalnym przed dodaniem enzymu
Jakość enzymu litycznego
9.2 Mutanty oporności u Aspergillus:
Oporność na azotany
Oporność na seleniany
Oporność na kwas fluoroorotowy
Eksperyment:
1) Płytka ze sporami
2) poddajemy ją działaniu UV
3) kiełkują delikatnie spory
4) Robimy replica - plater - odciskamy materiał z szalki Petriego na materiał, do którego się dobrze przyklejają zarodniki.
5) Przechodzą one na materiał w tym samym miejscu co były na płytce
6) Potem do tego przykładamy kilka płytek i hodujemy w różnych warunkach np. temperaturowych.
7) Patrzymy następnie gdzie rośnie, a gdzie nie i jak np. wyrosło w 42 st C a nie rośnie w 32 st C to te kolonie, u których to zaobserwowano, to na tej drugiej płytce to mutanty i je dalej badamy. 32 stC - Dziki szczep 42 stC - Nie wchodzi w mitozę
42 stC - Wszedł w mitozę, ale dalej problem
42 stC- Problem z dystrybucją jąder
Mutanty charakteryzuje się w testach komplementacji.
9.3 Komplementacje można przeprowadzać na heterokarionach.
1) Mutacje zarodników Aspergillus
2) Sprawdzenie czy zaszła i czy jest mutacja uzupełniana innym genem
Heterokarion - odpowiedź od razu - rośnie albo nie
Testy na komplementację i testy na dominację:
Test na komplementację przeprowadza się by stwierdzić, czy mutacje dające ten sam fenotyp są mutacjami w jednym genie.
Test na komplementacje u A.nidulans przeprowadza się w heterokarionach. Nie dochodzi wtedy do zlania jąder, ale układ może być analizowany jak organizm diploidalny. Przy analizie testu na komplementację, mutanty nie komplementujące, czyli z mutacjami w tych samych genach, przyporządkowuje się do jednej grupy komplementacyjnej.
(…)
… grupy komplementacyjnej.
Komplementacje obserwuje się wtedy, gdy po stworzeniu heterokarionu z dwóch szczepów wymagających do wzrostu np. argininy (Arg-) obserwujemy wzrost heterokarionu na pożywce minimalnej bez argininy. Mutanty komplementujące należą do różnych grup komplementacyjnych, co oznacza, że posiadają mutację w różnych genach.
9.4 Mutanty niezdolne do syntezy metioniny:
Szlak syntezy metioniny: cysteina - homocysteina - n-acetylohomocysteina - metionina
Sprawdzenie, czy mutant jest zdolny do wzrostu na pożywce minimalnej (bez metioniny)
Jak jest mutacja w pierwszym szlaku u jednego szczepu, a u drugiego szczepu w drugim szlaku i połączymy takie mutanty dając heterokarion to się geny uzupełniają wtedy wszystko działa.
Analiza heterokarionów u A.nidulans wykorzystywana…
… rodzicielskich.
Niektóre markery auksotroficzne (Arg, trp, ribo, meth) nadają szczepom sterylność.
Suplementacja cechy nie przywraca płodności.
9.5 Analizy takie pozwalają na analizowanie sprzężeń między genami:
Analiza fenotypu kiełkującej z askospor grzybni pozwala np. na badanie sprzężeń między genami- poprzez obserwację częstości powstawania rekombinantów.
Aby założyć krzyżówkę trzeba zmusić różne genetycznie grzybnie do wytworzenia heterokarionu, a następnie wejścia w cykl płciowy.
Osiąga się to szczepiąc konidia różniących się wymaganiami pokarmowymi szczepów na pożywce pozbawionej części uzupełnień. Jedynie utworzony heterokarion może rosnąć w tych warunkach.
Warunki beztlenowe i uboga pożywka wymuszają tworzenie klejstotecjów i powstanie askospor. U A.nidulans m.in. przy zakładaniu krzyżówek…
... zobacz całą notatkę
Komentarze użytkowników (0)