Frakcjonowanie komórek - materiały

Nasza ocena:

5
Pobrań: 252
Wyświetleń: 5362
Komentarze: 0
Notatek.pl

Pobierz ten dokument za darmo

Podgląd dokumentu
Frakcjonowanie komórek - materiały - strona 1 Frakcjonowanie komórek - materiały - strona 2 Frakcjonowanie komórek - materiały - strona 3

Fragment notatki:

Frakcjonowanie komórek:
Aby poznać szczegółowo funkcję poszczególnych struktur komórkowych w czystej postaci, tzn. bez wpływów czynników ubocznych, musimy te struktury wydzielić z komórki- wyizolować je w formie względnie czystej. Do tego celu służy technika frakcjonowania.
Struktury komórki poddane wzmożonemu działaniu siły (g) ulegają stratyfikacji, uwarstwieniu zgodnie ze swoja gęstością, kształtem i wielkością. Aby dokonać i mieć do dyspozycji odpowiednia ilość żądanej frakcji komórkowej, należy wybrać narząd, który składa się z możliwie jednorodnej populacji komórek, jak np. wątroba. Fragmenty rozdrobnionego narządu zawiesza się w roztworze odpowiedniej soli fizjologicznej i rozbija na poszczególne komórki , a następnie na elementy komórkowe , tj. frakcje w specjalnych urządzeniach zwanych - homogenizatorami. Roztarte komórki - homogenat, należy odwirować w wirówce. Chcąc rozdzielić frakcje komórkowe , sporządza się odpowiednie gradient sacharozy nalewając do specjalnej plastikowej probówki roztwór sacharozy - warstwami o malejącym stężeniu, poczynając od dna probówki , np. od roztworu 30%, 15%, 20%, 15%, 10%, 5% itd. Otrzymuje się w ten sposób gradient skokowy, w którym każda warstwa sacharozy różni się od pierwszej gęstością. Następnie układa się na powierzchnię sacharozy komórkowy homogenat i całość wiruje. W czasie wirowania składniki komórkowe wędrują w kierunku dna probówki - odśrodkowo (centryfugalnie) i zatrzymują się w tych warstwach sacharozy, które są zgodne z ich gęstością. Przy krótkim wirowaniu małych przeciążeniach osadzają się (sedymentują) najpierw całe komórki , powyżej zaś zatrzymują jądra komórkowe. Przedłużanie czasu wirowania i zwiększenie przeciążenia, czyli obrotów wirówki , powoduje nawarstwienie się w roztworze gradientowym , w probówce, ku jej powierzchni dośrodkowo (centrypetalnie), następujących frakcji : mitochondrialnej, liposomowej i najlżejszej mikroomowej. Każdą z frakcji można odzyskać i poddać oczyszczaniu przez ponowne wirowanie. Czystość poszczególnych frakcji , jej homogenność , ocenia się przez oznaczenie aktywności enzymów charakterystycznych dla danej frakcji (enzymy, markery).
Na przykład dla frakcji liposomowej enzymem znacznikowym jest kwaśna fosfataza. Czystość frakcji można też sprawdzić w mikroskopie elektronowym.
Elektroforeza żelowa:
Technika wirowania różnicowego jest przydatna do rozdzielenia na frakcje poszczególnych elementów komórkowych, natomiast rozdział cząsteczek białek ta techniką jest kosztowny i mało wydajny. Cząsteczki białka, których wielkość jest mniejsza od 10kDa. Bardzo trudno rozdzielić. Sedymentację małych cząsteczek utrudnia albo wręcz uniemożliwia, zjawisko dyfuzji zwrotnej występującej w ośrodku, w którym są zawieszone cząsteczki białka . aby przezwyciężyć te trudności, zastosowano rozdział elektroforetyczny, w którym siłę odśrodkowa wytwarzaną przez wirówkę zastąpiono polem elektrycznym. W polu elektrycznym cząsteczki wędrują w gęstym środowisku żelu skrobiowego lub akrylowego. Metoda elektroforezy żelowej pozawala rozdzielić bardzo precyzyjnie zarówno duże cząsteczki białek ,jak i krótki polipeptydy. Metodą elektroforezy żelowej można również rozdzielić kwasy nukleinowe z dokładnością do pojedynczych nukleotydów.


(…)

… wypływają z kolumny na różnych etapach zastosowanego malejącego gradientu siły jonowej.
Powinowactwo:
Wysoka specyficzność oddziaływań enzym-substrat, receptor-ligand i przeciwciało-antygen oznacza, że właściwość te można wykorzystać do bardzo wydajnego oczyszczania białka. Na przykład kolumna wypełniona nośnikiem, z którym jest związany kowalencyjnie hormon insulina, będzie specyficznie wiążała…
… , natomiast do drugiego ze znakiem ujemnym, natomiast do drugiego ze znakiem dodatnim. Po włączeniu prądu stałego cząsteczki białek umieszczone na szczycie kolumny lub płytki żelowej migrują w polu elektrycznym z prędkością zależną od ich masy cząsteczkowej i wypadkowego ładunku.
Żelowe układy rozdzielające są czymś w rodzaju sita cząsteczkowego z przestworami o wielkościach przez które mogą migrować cząsteczki białka…
… od wartości w punkcie izoelektrycznym, cząsteczki białka wędrują w kierunku anody. Jeżeli natomiast pH buforu ma dokładną wartość punktu izoelektrycznego danego białka , to jego cząsteczki nie wędrują, zostają w żelu nieruchome.
W celu rozdzielenia mieszaniny białek według ich masy cząsteczkowej, elektroforezę przeprowadza się w obecności siarczanu dodecylu sodu (SDS). Poszczególne łańcuchy białek tworzą kompleksy z cząsteczkami SDS posiadającymi ładunki ujemne elektryczne i migrują w kierunku anody zgodnie z masą cząsteczkową. Duże kompleksy składające się z podjednostek białkowych, których łańcuchy są połączone mostkami dwusiarczkowymi (-S-S-), należy przed rozdziałem zredukować za pomocą merkaptoetanolu rozbijającego wiązania dwusiarczkowe. Dopiero po takim zabiegu rozpuszcza się białka w buforze SDS…
… łączy je w pobliżu końca C łańcucha β (prążka 2).
Białko prążka 4.1 wiąże się w regularnych odstępach ze spektryną. W tych miejscach końce dimerów spektryny wiążą dodatkowo F-aktynę (5) i przyjmuje się że białko 4.1 zwiększa ich wzajemne oddziaływanie . F-aktyna występuje w formie krótkich mikrofilamentów (100nm) zbudowanych z dwóch łańcuchów, każdy z 15 cząsteczek aktyny G. wydaje…
... zobacz całą notatkę

Komentarze użytkowników (0)

Zaloguj się, aby dodać komentarz