To tylko jedna z 3 stron tej notatki. Zaloguj się aby zobaczyć ten dokument.
Zobacz
całą notatkę
ANALIZA CHEMICZNA BIOMOLEKUŁ cz.II Chromatografia jonowymienna to rodz aj cieczowej chromatografii kolumnowej. Jest to metoda preparatywna używana do wydzielenia z mieszaniny żądanej substancji. W tej metodzie chromatografii faza stacjonarna, złoże, jest obdarzona ładunkiem. Stanowi je zazwycz aj żywica jonowymienna, zawierająca obdarzone ładunkiem grupy funkcyjne, oddziałujące z przeciwnie naładowanymi grupami związków, które mają zostać zatrzymane przez nośnik: • pozytywnie naładowany jonowymieniacz (anionit) wiąże aniony • negatywie naładowany jonowymieniacz (kationit) wiąże kationy. Związki związane z jonowymieniaczem mogą być wymyte z kolumny przez stopniową elucję, a także poprzez zmianę stężenia soli l ub pH. Tego rodzaju chromatografii używa się do oddzielania takich związków jak aminokwasy , peptydy i białka. Chromatografia jonowymienna jest powszechnie stosowana do oczyszczan ia białek w systemie FPLC. Zalety i wady chromatografii jonowymiennej Zalety: − wysoka rozdzielczość metody oraz znaczna jej selektywność − możliwość stosowania próbek o objętościach znacznie przekraczających objętość kolumny i o bardzo niskiej koncentracji separowanych makromolekuł − możliwość zatężania rozdzielanych makromolekuł przy pracy w technice gradientowej − duża pojemność kolumny Wady: − konieczność stosowania próbek w roztworze o niskiej sile jonowej i dokładnie określonej wartości pH − rozdzielone molekuły wymywane są zwykle w eluencie o wysokiej zawartości soli, którą trzeba później usunąć innymi technikami. Wybór warunków chromatografii jonowymiennej: 1. Jeśli znamy pI białka: • Białka zasadowe- pI tych białek przypada w zakresie pH stosujemy kationit (polianion). Nanosimy białko w pH niższym ◊zasadowego niż pI. Np. białko o pI 8 będzie kationem w pH np. 6,5 i zwiąże się do bufor o wyższym pH niż pH nanoszonego roztworu ◊kationitu. Elucja białka stosujemy anionit◊ • Białka kwaśne – o pI przypadającym w pH kwaśnym (polikation). Nanosimy próby w buforze o pH wyższym niż pI białka. Np. białko o pI 2,5 będzie anionem e pH 3,7 i zwiąże się do anionitu. bufor o pH niższym niż to w którym nanoszono białko. ◊Elucja 2. Elucje białka z kolumny można prowadzić dwoma sposobami: • Zmiana pH buforu, którym przemywamy złoże • Zwiększenie siły jonowej eluentu Bufory jakich używamy w chromatografii jonowymiennej: 1. Dla kationitów: fosforanowy, octanowy, cytrynianowi, maleinowy, weronalowi, HEPES 2. Dla anionitów: Tris, bis-Tris, etanoloamina, imidazol Wracając do drugiego sposobu elucji, możemy tego dokonać zwiększając stężenie wcześniej używanego buforu, bądź
(…)
… etydyny
• coomassie blue
• srebro
• stains-all
Elektroforeza analityczna służy do charakterystyki badanego preparatu na danym etapie doświadczenia. W
przypadku kwasów nukleinowych umożliwia ona uzyskanie następujących informacji:
1. Ustalenie wielkości fragmentów DNA lub cząsteczek RNA na podstawie porównania tempa migracji
badanych prążków w stosunku do wzorca mas cząsteczkowych. Wzorcem jest preparat…
… etydyny
• coomassie blue
• srebro
• stains-all
Elektroforeza analityczna służy do charakterystyki badanego preparatu na danym etapie doświadczenia. W
przypadku kwasów nukleinowych umożliwia ona uzyskanie następujących informacji:
1. Ustalenie wielkości fragmentów DNA lub cząsteczek RNA na podstawie porównania tempa migracji
badanych prążków w stosunku do wzorca mas cząsteczkowych. Wzorcem jest preparat…
... zobacz całą notatkę
Komentarze użytkowników (0)