Ćwiczenia - chromatografia

Nasza ocena:

3
Pobrań: 273
Wyświetleń: 2079
Komentarze: 0
Notatek.pl

Pobierz ten dokument za darmo

Podgląd dokumentu
Ćwiczenia - chromatografia - strona 1 Ćwiczenia - chromatografia - strona 2 Ćwiczenia - chromatografia - strona 3

Fragment notatki:

ANALIZA CHEMICZNA BIOMOLEKUŁ cz.II Chromatografia jonowymienna  to rodz aj cieczowej  chromatografii kolumnowej.  Jest to metoda preparatywna  używana do wydzielenia z  mieszaniny  żądanej substancji. W tej metodzie  chromatografii  faza stacjonarna, złoże, jest obdarzona ładunkiem. Stanowi je zazwycz aj żywica  jonowymienna, zawierająca obdarzone ładunkiem grupy funkcyjne, oddziałujące z przeciwnie naładowanymi grupami  związków, które mają zostać zatrzymane przez nośnik: • pozytywnie naładowany jonowymieniacz (anionit) wiąże  aniony • negatywie naładowany jonowymieniacz (kationit) wiąże  kationy.   Związki związane z jonowymieniaczem mogą być wymyte z kolumny przez stopniową elucję, a także poprzez  zmianę stężenia  soli l ub pH. Tego rodzaju  chromatografii  używa się do oddzielania takich związków jak  aminokwasy , peptydy  i białka.   Chromatografia  jonowymienna jest powszechnie stosowana do oczyszczan ia białek  w systemie  FPLC. Zalety i wady chromatografii jonowymiennej Zalety: − wysoka rozdzielczość metody oraz znaczna jej selektywność − możliwość stosowania próbek o objętościach znacznie przekraczających objętość kolumny i o bardzo niskiej  koncentracji separowanych makromolekuł − możliwość zatężania rozdzielanych makromolekuł przy pracy w technice gradientowej − duża pojemność kolumny Wady: − konieczność stosowania próbek w roztworze o niskiej sile jonowej i dokładnie określonej wartości pH − rozdzielone molekuły wymywane są zwykle w eluencie o wysokiej zawartości soli, którą trzeba później  usunąć innymi technikami. Wybór warunków chromatografii jonowymiennej:  1. Jeśli znamy pI białka: • Białka zasadowe- pI tych białek przypada w zakresie pH stosujemy kationit (polianion). Nanosimy białko w pH  niższym ◊zasadowego niż pI. Np. białko o pI 8 będzie kationem w pH np. 6,5 i zwiąże się do  bufor o wyższym pH niż  pH nanoszonego roztworu ◊kationitu. Elucja  białka stosujemy anionit◊ • Białka kwaśne – o pI przypadającym w pH kwaśnym (polikation). Nanosimy próby w buforze o pH wyższym niż pI  białka. Np. białko o pI 2,5 będzie anionem e pH 3,7 i zwiąże się do anionitu. bufor o pH niższym niż to w którym  nanoszono białko. ◊Elucja  2. Elucje białka z kolumny można prowadzić dwoma sposobami: • Zmiana pH buforu, którym przemywamy złoże • Zwiększenie siły jonowej eluentu Bufory jakich używamy w chromatografii jonowymiennej: 1. Dla kationitów: fosforanowy, octanowy, cytrynianowi, maleinowy, weronalowi, HEPES 2. Dla anionitów: Tris, bis-Tris, etanoloamina, imidazol Wracając do drugiego sposobu elucji, możemy tego dokonać zwiększając stężenie wcześniej używanego buforu, bądź 

(…)

… etydyny
• coomassie blue
• srebro
• stains-all
Elektroforeza analityczna służy do charakterystyki badanego preparatu na danym etapie doświadczenia. W
przypadku kwasów nukleinowych umożliwia ona uzyskanie następujących informacji:
1. Ustalenie wielkości fragmentów DNA lub cząsteczek RNA na podstawie porównania tempa migracji
badanych prążków w stosunku do wzorca mas cząsteczkowych. Wzorcem jest preparat…
… etydyny
• coomassie blue
• srebro
• stains-all
Elektroforeza analityczna służy do charakterystyki badanego preparatu na danym etapie doświadczenia. W
przypadku kwasów nukleinowych umożliwia ona uzyskanie następujących informacji:
1. Ustalenie wielkości fragmentów DNA lub cząsteczek RNA na podstawie porównania tempa migracji
badanych prążków w stosunku do wzorca mas cząsteczkowych. Wzorcem jest preparat…
... zobacz całą notatkę

Komentarze użytkowników (0)

Zaloguj się, aby dodać komentarz