Izolacja i oczyszczanie białek
1) Izolacja chromatyny z wybranej tkanki
2) Ekstrakcja białek związanych z chromatyną (zależnie od właściwości białek, dla słabiej związanych 0,3M NaCl, silniej 0,6-2M NaCl)
3) Rozpuszczenie mieszaniny białek w TCA
4) Oczyszczenie przy użyciu chromatografii jonowymiennej na kolumnach (Sephadex C-25)
Liczne białka wrażliwe na degradację (peptydazy komórkowe) stąd izolacja prowadzona często wobec inhibitora peptydaz- PMSF oraz niskiej temp.
Produkcja dużych ilości białek rekombinowanych wymaga konstrukcji wektorów ekspresyjnych niosących jako wstawkę cDNA interesującego nas białka z dołączonym znacznikiem umożliwiającym wydajną izolację metodami chromatografii powinowactwa
Brak uniwersalnych metod oczyszczania wszystkich białek.
Techniki analizy i puryfikacji białek:
1) Elektroforeza żelowa- stopień usieciowania żelu umożliwia frakcjonowanie białek ze względu na ich rozmiar. Mieszanina białek rozpuszczalna w detergentach (SDS- nadaje ładunek), z dodatkiem ME, DTT (niszczą mostki S-S)
2) Chromatografia
Filtracja żelowa (sączenie molekularne)
Jonowymienne
Powinowactwa
3) Ultrawirowanie w gradiencie gęstości (sacharozy)
4) Spektroskopia masowa
Techniki chromatograficzne:
Filtracja żelowa kolumny z Sephadex, Sepharose:
Małe białka wnikają do środka ziaren złoża i zatrzymują się na kolumnie, duże przepływają.
Jonowymienna: wykorzystuje powinowactwo białek wobec złoża (jego wypadkowy ładunek elektryczny inny dla każdego białka).
Kolumny: Dodatnio naładowane złoże (DEAE-celuloza) wyłapuje białka obdarzone „-„
Ujemnie naładowane złoże (CM-celuloza) wyłapuje białka „+”
Powinowactwa:
1) Kowalencyjne przyłączenie gr X (np. glukoza)
2) Nałożenie mieszaniny białek na kolumnę
3) Przemycie buforem (usuwa białka niezwiązane)
4) Elucja białek związanych
Np. Konkanawalina- białko roślinne wiąże się z glukozą (większość innych białek nie wykazuje powinowactwa do glukozy i przepływa przez kolumnę)
Konkanawalina uwalniana jest z kolumny przemyciem jej stężonym r-rem glukozy.
Ultrawirowanie w gradiencie gęstości sacharozy:
Metoda wykorzystuje współczynnik sedymentacji [S] inny dla poszczególnych białek.
Białka podczas wirowania przemieszczają się zgodnie z gradientem zależnie od charakterystycznych dla siebie współczynników V sedymentacji zależna od masy białka, kształtu gęstości.
... zobacz całą notatkę
Komentarze użytkowników (0)